一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1869681A [43]公开日2006年11月29日
[21]申请号200610086801.X [22]申请日2006.06.16
[21]申请号200610086801.X
[71]申请人北京联合大学应用文理学院保健食
品功能检测中心
地址100083北京市海淀区北土城西路197号北
京联合大学应用文理学院保健食品功能检
测中心
[72]发明人文镜 常平 [74]专利代理机构北京华旗新智知识产权代理有限责任公司代理人赵海明
[51]Int.CI.G01N 30/00 (2006.01)G01N 1/28 (2006.01)G06F 19/00 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 2 页
[54]发明名称
一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测
方法
[57]摘要
本发明涉及一种功能红曲Monacolin类化合物
含量的检测方法，它包括以下步骤：1)试样前处理；
2)酸式Monacolin K标准样品的制备；3)色谱进样
分析；4)图谱分析和结果计算。

本发明是通过高效
液相色谱仪将功能红曲提取液中各Monacolin类化
合物良好地分离，用二极管阵列检测器检测出各Mo
nacolin类化合物的紫外吸收光谱，最后用外标法
根据保留时间及紫外吸收光谱图进行定性，用峰面
积定量。

本发明能够在缺乏Monacolin化合物标准
样品的情况下，通过检测样品中Monacolin类化合
物共有的特征紫外吸收光谱，检测出样品中Monaco
lin类化合物的总含量。

该方法具有良好的准确度、
精密度、线性关系，对功能红曲样品进行检测能够
取得良好结果。

200610086801.X权 利 要 求 书第1/2页 1.一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法，它包括以下步骤：
1)试样前处理；
2)酸式Monacolin K标准样品的制备；
3)色谱进样分析；
4)图谱分析和结果计算。

2、根据权利要求1所述的功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法，其特征在于：
1)试样前处理步骤中包括：将红曲样品粉碎(≥80目)并充分混合均匀；准确称取400.0～600.0mg样品于50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，摇匀，室温下超声20min(工作频率40KHz)。

加75％乙醇至接近刻度，再超声10min，之后冷却至室温，用75％乙醇定容至50ml；用3500转/分离心10min；取上清液过0.45μm孔径微孔滤膜，滤液待进样；
2)酸式Monacolin K标准样品的制备步骤包括：称取Monacolin K(内酯)标准品4mg，以0.2M氢氧化钠溶液定容至100ml，置50℃条件下超声转化1小时，冷却至室温后，避光放置3小时后使用；根据转化后酸式Monacolin K及残留内酯Monacolin K色谱峰面积计算转化率；利用制备的酸式Monacolin K，对样品中酸式Monacolin K进行准确定性及定量；
3)色谱进样分析步骤包括：取经微孔滤膜过滤的滤液进入液相色谱仪，所述色谱仪的色谱条件为：色谱柱：C18柱，4.6×250mm，5μm；柱温：室温；二极管阵列检测器：200～350nm扫描，238nm处色谱图处理数据；流动相：甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；
4)图谱分析和结果计算步骤包括：在色谱流出曲线图上找到与标准Monacolin K有相同紫外吸收光谱的组分峰，即为Monacolin类化合物，将这些组分的峰面
200610086801.X权 利 要 求 书 第2/2页积相加，与标准Monacolin K色谱峰面积比较，计算样品中Monacolin类化合物总量；
结果的计算公式：
式中：X-式样中Monacolin类化合物总量，mg/g
h1-具有Monacolin类化合物特征吸收光谱的被分离组分色谱峰面积之和 c-标准Monacolin K(内酯型或酸式)溶液浓度，mg/ml
50-试样定容体积，ml
h2-Monacolin K(内酯型或酸式)峰面积
m-试样称取量，g。

200610086801.X说 明 书第1/10页一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种保健食品功效成分检测方法。

背景技术
红曲作为天然色素和食品添加剂广泛应用于食品工业。

1979年远腾报道从红曲霉发酵液中分离得到一种具有降血浆胆固醇作用的物质，称为Monacolin K，并发现其有抑制人体内胆固醇合成的作用。

以后的研究证实红曲霉在其生长后期能产生的一类对动物和人体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA 还原酶)有抑制活性的物质，既Monacolin类化合物。

它们是一族结构类似物，可分为：Monacolin J、K、L、X、M、Dihydromevinolin及Dihydromonacolin L 等成分。

其中以Monacolin K含量最多。

由于Monacolin类物质抑制胆固醇合成效果显著，毒副作用小，耐受性好，自发现以来便很快应用于临床。

近年来Monacolin化合物又作为保健食品功效成分应用于一些具有降血脂功能的保健食品而受到广大消费者的欢迎。

为了保证产品质量，对于原料及产品中M o n a c o l i n类物质的检测就显得十分重要。

自2000年以来本实验室在《中国食品添加剂》及《食品科学》杂志上陆续报道了用紫外分光光度计及反相高效液相色谱—紫外检测器测定红曲中Monacolin K(又称Lovastatin)含量的方法。

由于紫外检测器只能得到单一波长下各组分的色谱流出曲线图，而不能得到随色谱组分流出的各组分吸收光谱图；又由于目前许多Monacolin化合物的标准样品没有商品出售，因此给分离出的各组分定性带来困难。

故以前对于红曲中降血脂功能因子的定量测定，实际上只测定Monacolin类化合物中含量最多的Monacolin K，而忽略了红曲中其它Monacolin类化合物。

显然这对于准确评价红曲中抑制胆固醇合成的功能因子是
有缺陷的。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法。

本发明是这样实现的：
一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法，它包括以下步骤：
1)试样前处理；
2)酸式Monacolin K标准样品的制备；
3)色谱进样分析；
4)图谱分析和结果计算。

所述的功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测方法，其具体步骤还可以为：
1)试样前处理步骤中包括：将红曲样品粉碎(≥80目)并充分混合均匀；准确称取400.0～600.0mg样品于50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，摇匀，室温下超声20min(工作频率40KHz)。

加75％乙醇至接近刻度，再超声10min，之后冷却至室温，用75％乙醇定容至50ml；用3500转/分离心10min；取上清液过0.45μm孔径微孔滤膜，滤液待进样；
2)酸式Monacolin K标准样品的制备步骤包括：称取Monacolin K(内酯)标准品4mg，以0.2M氢氧化钠溶液定容至100ml，置50℃条件下超声转化1小时，冷却至室温后，避光放置3小时后使用；根据转化后酸式Monacolin K及残留内酯Monacolin K色谱峰面积计算转化率；利用制备的酸式Monacolin K，对样品中酸式Monacolin K进行准确定性及定量；
3)色谱进样分析步骤包括：取经微孔滤膜过滤的滤液进入液相色谱仪，所述色谱仪的色谱条件为：色谱柱：C18柱，4.6×250mm，5μm；柱温：室温；二
极管阵列检测器：200～350nm扫描，238nm处色谱图处理数据；流动相：甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；
4)图谱分析和结果计算步骤包括：在色谱流出曲线图上找到与标准Monacolin K有相同紫外吸收光谱的组分峰，即为Monacolin类化合物，将这些组分的峰面积相加，与标准Monacolin K色谱峰面积比较，计算样品中Monacolin类化合物总量；
结果的计算公式：
式中：X-式样中Monacolin类化合物总量，mg/g
h1-具有Monacolin类化合物特征吸收光谱的被分离组分色谱峰面积之和 c-标准Monacolin K(内酯型或酸式)溶液浓度，mg/ml
50-试样定容体积，ml
h2-Monacolin K(内酯型或酸式)峰面积
m-试样称取量，g。

功能红曲发酵产物含有各种M o n a c o l i n类化合物，以内酯型和酸式Monacolin K为主。

在脱水干燥处理的过程中，酸式Monacolin K逐渐转变为内酯型。

由于它们都有生理活性，所以测定Monacolin化合物总量更有意义。

二极管阵列检测器能够给出所有被分离组分色谱流出即时紫外吸收光谱，因此在色谱流出曲线图上可以清楚地看那些与Monacolin K有相同紫外吸收光谱的Monacolin类化合物被分离的情况。

如果有标准物质，对它们一一定性、定量十分方便。

例如由于酸式Monacolin K不稳定，因此目前没有标准物质出售。

利用本方法提供的条件能够很方便地将标准内酯型Monacolin K转化为酸式。

用转化后的标准样品进样，就能够准确对样品中的酸式Monacolin K定性和定量。

把那些与Monacolin K有相同紫外吸收光谱的Monacolin类化合物组分的峰面积相加，用标准内酯型Monacolin K对它们定量就能够得到样品中Monacolin 类化合物的总量。

尽管不同的Monacolin化合物对检测器的响应可能有差异，得
到的结果会有一些误差，但是在目前缺乏Monacolin类化合物标准物的情况下，这一方法还是行之有效的。

又由于样品中各种Monacolin类化合物以内酯型和酸式Monacolin K为主，内酯型Monacolin K有商品出售，本方法又解决了酸式Monacolin K标准样品的制备问题，而其他Monacolin类化合物含量很少，所以采用本方法测定功能红曲样品中M o n a c o l i n化合物总量有较高的准确度。

如果样品中有效成分含量过低，可将提取离心后的上清液用减压浓缩法适当浓缩，但结果需要按浓缩后的准确体积计算。

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图说明
图1为Monacolin K(内酯式)Monacolin K acid(开环酸式)标准色谱图 图2为某红曲样品色谱图
图3为Monacolink标准曲线
具体实施方式
一种功能红曲中Monacolin类化合物含量的检测
1.材料
1.1试剂
1.1甲醇 色谱纯
1.2无水乙醇 分析纯
1.3磷酸 分析纯
1.4氢氧化钠 分析纯
1.5Monacolin K准储备液 准确称取Monacolin K(内酯型)标准品40.0mg，以流动相定容100ml。

此溶液浓度为400μg/ml。

1.6Monacolin K标准工作液 准确量取Monacolin K标准储备液1ml，以流动相定容10ml。

此溶液浓度为40μg/ml。

1.2仪器设备
1.2.1高效液相色谱仪(Waters 600E)
1.2.2二极管阵列检测器(Photodiode Array Detecter，Waters 2996) 1.2.3低速离心机(上海手术器械厂，80-2)
1.2.4超纯水系统(美国PALL)
1.2.5超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，KQ-100)
1.2.6精密分析天平(Mettler AE-100)
2.方法
2.1试样处理
将功能红曲样品粉碎(≥80目)并充分混合均匀。

准确称取400.0～600.0mg 样品于50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，摇匀，室温下超声20min (工作频率40KHz)。

加75％乙醇至接近刻度，再超声10min，之后冷却至室温，用75％乙醇定容至50ml。

用3500转/分离心10min。

取上清液过0.45μm孔径微孔滤膜，滤液待进样。

2.2酸式Monacolin K标准品的制备
称取Monacolin K(内酯)标准品4mg，以0.2M氢氧化钠溶液定容至100ml，置50℃条件下超声转化1小时，冷却至室温后，避光放置3小时后使用。

根据转化后酸式Monacolin K及残留内酯Monacolin K色谱峰面积计算转化率。

利用制备的酸式Monacolin K，对样品中酸式Monacolin K进行准确定性及定量。

2.3色谱条件
色谱柱：C18柱4.6×250mm 5μm
柱温：室温
二极管阵列检测器：200～350n m扫描，238n m处色谱图处理数据
流动相：甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
2.4图谱分析
取处理好的试样提取液20μl进样，经二极管阵列检测器检测得到图谱后，以标准Monacolin K(内酯及酸型)保留时间及Monacolin类化合物特征吸收光谱定性。

以238nm波长下的色谱图为定量依据，将样品中Monacolin组分峰面积之和与标准M o n a c o l i n K(内酯或酸式)色谱峰面积比较定量。

2.5结果的计算公式
式中：X-式样中Monacolin类化合物总量，mg/g
h1-具有Monacolin类化合物特征吸收光谱的被分离组分色谱峰 面积之和。

c-标准M o n a c o l i n K(内酯型或酸式)溶液浓度，m g/m l 50-试样定容体积，ml
h2-Monacolin K(内酯型或酸式)峰面积
m-试样称取量，g
3.实验结果
3.1色谱分离效果考察试验
在上述实验条件下标准Monacolin K(内酯及酸型)分离情况如图1所示，某红曲样品Monacolin类化合物分离情况如图2所示。

从图1可以看到，在上述试验条件下，内酯型Monacolin K与开环酸式Monacolin K得到良好分离。

从图2可以看到，在上述试验条件下，红曲样品中的各种Monacolin化合物得到良好分离。

二极管阵列检测器给出了所有被分离组分色谱流出即时紫外吸收光谱。

将这些光谱中具有Monacolin化合物特征(230，238，246nm波长处各有一个吸收峰，以238nm处为最大)的图谱挑出来，在色谱流出曲线图中这些特征光谱所对应的色谱峰即为各Monacolin化合物。

3.2线性关系及最低检测限的考察试验
配置浓度为0.1、1、10、30、75、150、300μg/ml Monacolin K(内酯型)标准溶液，在上述色谱条件下进样测定，以峰面积对浓度作标准曲线，结果如图3所示。

其线性回归方程及相关系数分别为：Y＝66084x-16840，R2＝0.9999。

表明在这一浓度下线性关系良好。

当Monacolin K浓度为0.1μg/ml时，在色谱流出曲线图上能够看到Monacolin K的色谱峰略高于2倍噪声，因此本方法的最低检出量为0.1μg/ml(2ng)。

根据此标准曲线可知本方法的最佳线性范围为0.1～300μg/ml。

3.3方法平行性精密度试验
将同一均匀样品分为5份，从前处理步骤开始平行进行实验，5份样品测定结果见表1。

表1 平行性精密度测定结果
Monacolin化合物测
序号定结果
(g/100g)
平均值RSD
1 2 30.294
0.296
0.293
0.2940.002
结果表明该方法具有良好的平行性精密度。

3.4方法重复性精密度试验
同一均匀样品在同样实验条件下从样品前处理开始每天测定一次。

连续测量5天，其结果见表2。

表2 重复性精密度测定结果
结果表明该方法重复性精密度良好。

3.5方法回收率试验
精确称取样品10份，其中5份各加入标准Monacolin K 。

从样品前处理开始测定10份样品中Monacolin K含量。

结果如下： 表3 方法回收率测定结果
45
0.2920.296
Monacolin化合物测定序号
结果
(g/100g)平均值
RSD
12345
0.410.430.420.420.44
0.424
2.69％
N
值
样品中
Monacolin K
含量mg
加入
量
mg
检出Monacolin K
含量
mg
回收率
％
平均值
表3表明此方法具有良好的准确度。

3.6 5种样品中Monacolin化合物含量的测定
各取5种红曲样品，以上述检测方法测定其中Monacolin 化合物含量，结果如下：
表4 样品中Monacolin化合物含量测定结果
12345
0.640.710.710.690.65
2.02.02.02.02.0
2.602.642.702.642.73
98.396.599.397.897.9
97.96％
序号
样品名称
重复测定
次数
Monacolin化合物测定
结果
(g/100g)
1
2
3
4
5
XX红曲样
品1
XX红曲样
品2
XX红曲样
品3XX红曲样
品4XX红曲样
品5
6
6
6
6
6
1.02±0.020.80±0.01
0.99±0.02
1.20±0.11
0.45±0.10
从表4可以看出，本方法在实际应用中能够取得良好的结果。

4.讨论
4.1功能红曲发酵产物含有各种Monacolin类化合物，以内酯型和酸式Monacolin K为主，二极管阵列检测器能够给出所有被分离组分色谱流出即时紫外吸收光谱，本方法能够在色谱流出曲线图上清楚地反映出那些与Monacolin K 有相同紫外吸收光谱的M o n a c o l i n类化合物被分离的情况(见图2)。

4.2内酯型Monacolin K有商品出售。

由于酸式Monacolin K不稳定，因此目前没有标准物质出售。

利用本方法提供的条件能够很方便地将标准内酯型Monacolin K转化为酸式。

用转化后酸式及内酯型Monacolin K色谱峰面积之比，就能够准确得到转化率，并能够准确对样品中的内酯型及酸式Monacolin K定量。

4.3采用二极管阵列检测器能够对所有被分离组分进行色谱流出即时紫外吸收光谱扫描。

因此，本方法除了采用Monacolin K的保留时间定性之外，可以同时利用Monacolin K的特征吸收光谱定性。

这就使得该方法的定性分析比以往紫外检测器只能利用保留时间定性更加可靠。

4.4Monacolin类化合物都有类似Monacolin K的生理活性，把这些组分的峰面积
相加，用标准内酯型Monacolin K对它们定量就能够得出样品中Monacolin类化合物的总量，尽管由于检测器响应的问题，会有一些误差，但是在目前缺乏Monacolin类化合物标准物质的情况下，这一方法还是行之有效的。

又由于样品中各种Monacolin类化合物以内酯型和酸式Monacolin K为主(见图2)，利用本方法可以对这两种化合物准确定量，而其他Monacolin化合物含量很少，所以采用本方法测定功能红曲样品中M o n a c o l i n化合物总量有较高的准确度。

200610086801.X说 明 书 附 图第1/2页
图1
200610086801.X说 明 书 附 图 第2/2页
图2
图3。