光合细菌球形红细菌降解HMX

352赵婷婷，白红娟，康鹏洲，王寿艳文章编号：1006-9941(2018)04-0352-07
光合细菌球形红细菌降解HMX
赵婷婷，白红娟，康鹏洲，王寿艳
(中北大学环境与安全工程学院，山西太原030051)
摘要：研究了供氧光照、奥克托今（H M X)初始浓度、接种量、p H值和温度对驯化球形红细菌菌株
降解H M X能力的影响，对其降解动力学方程进行了拟合分析。

通过改变1个影响因素，固定其它4个条件，确定了球形红细菌降解H M X的最适宜条件。

用分光光度计对H M X浓度和球形红细菌细胞生物量进行了测定。

结果表明，驯化后的球形红细菌可高效降解奥克托今，球形红细菌H菌株在不同供氧光照条件下均能很好生长并降解H M X，且降解率均70%以上，最佳降解条件光照厌氧。

该菌株降解H M X的最适条件为：H M X初始浓度为100m g•L_\p H值为7.0、接种量为15%，温度为30T，在96h 降解率达到最高，为88.9%。

球形红细菌降解H M X的过程符合动力学方程。

关键词：奥克托今（H M X);球形红细菌；微生物降解；动力学方程
中图分类号：T j55; X172文献标志码：A D O I: 10.11943/j.i s s n.1006-9941.2018.04.011
1引言
奥克托今（H M X)具有八元环的硝胺结构，是现今 综合性能最好的 ，其 好的 能[广
泛应用于导弹、、和反坦克导弹的战斗部装药。

生 用H M X过程中的不 的环
，HMX的，美国 漱
其 物 ⑴。

国内外处理H M X废水的常用方法包括光催化⑵、超临界水氧化[3、三维电解法⑷、纳米零价铁处 理炸药废水[5]以及微生物处理等。

物理化学方法一般仅适于浓度较高的有机废水处理，对浓度较低的有 机 效果差且成本高。

微生物 高效、环境友好、处理成本低等特点，一直是研究的热点方向。

目前已经分离得到降解H M X的菌种有：硫酸还原菌 (spp)[6]、摩根菌摩氏菌（/Morgene//a morgan/7)和 >氏普罗烕登斯菌（Pro w/enc/a reff-geW)[7]和克氏梭状芽孢杆菌（C/osfW c/m k/yveW)及曲霉菌（A speg/7/s n g e)[8]等。

这些菌种均能降解H M X，但只能在严格好氧或严格厌氧条件下进行，降解时间较长，而且还会引起其他物质的积累。

因此，这些因素限制了它们进一步应用。

光合细菌在不同供氧光照的条件下均可降解有机 物，而且它所要求的条件也不像一般的专属好氧菌和专属厌氧菌那样严格[9]。

特别是紫色非硫细菌不仅能在厌氧光照的条件下进行光能异养生长，而且能在 好氧黑暗条件下进行好气异养生长。

光合细菌这种随 着生存 灵活改变代谢类型的特性，较其他微生
物材料 越性[1°]。

此，国对光合细菌进行了的研究，并成功 了（如：2,4,6-三硝基 甲苯和2,4-二硝基甲苯）[1]、、 苯酚、氯 苯[2_1]等废水。

用光合细菌H M X的研究
国。

本研究初次采用球形红细菌(/^ocObactew sphaero/c/es)降解 H M X，研究了不同理 化因素对驯化的球形红细菌降解H M X能力的影响，对其降解动力学过程进行了拟合分析，为该菌株在 杂氮化合物废水污染治理中的应用提供参考。

2材料与方法
收稿日期：20179091;修回日期：20179190
基金项目：山西省回国留学人员科研资助项目（201 6三84)
作者简介：赵婷婷（991-)，女，研究生,微生物技术研究。

e-m a il:331478674@q q.c o m
通信联系人：白红娟（969-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事环 境微生物技术研究。

e-m a il:b h j44871@163.c o m 2.1材料
菌种：球形红细菌（/h o C o b a c fr sphaero/Ces)H 菌株系紫色非硫菌群红细菌属光合细菌，由山西大学 光合细菌研究室分离、鉴定 存[16]。

基础培养基：酵母膏10 g，MgS〇402 g，CaCI2a°7 g,
Chinese Journal of Enerj^etic Materials, Vol.26 , N o.4, 2018 (352_358) 含能材料www. e nergetic-materials, o rg x n
光合细菌球形红细菌降解h m x353
(NH4)2S〇41.25 g，苹果酸 2.5 g，KH2P〇40.6g，K2HP〇40.9 g，蒸馏水1000 m L，pH7.0;驯化培养基：基础培养基加适量h m x。

试剂：H M X，99%，购自阿拉丁公司。

2.2方法
2.2.1 菌种的驯化
将10%。

原始菌液接人H M X含量为100mg •L-1的驯化培养基，在30 °C、2500l x光照培养 氧驯化培养10 d'驯化菌种。

2.2.2球形红细菌H菌株降解H M X实验
球形红细菌生 H M X降解实验均在密封无菌条
件下进行，将10 m L驯化后的菌悬液10000 r •m irT1离 心10 m in，弃上清液，菌体用磷酸缓冲液洗涤2次后，用培养基成菌，备用。

在H M X浓度为100mg •L_1的基础培养基中，接种15 m L的菌悬液 (细胞生物量〇D值为0.551 )，用1m o l L-1的HCI 和Na〇H溶液分别调节PH至7.0,在温度30 °C，厌 氧光照条件（（养物，，光照度：2500 lx，静置）培养 0,12,24,36,48,60,72,84,96h 后。

离心菌体10 m in(转速10000 r •m in—1)，测定上 清液中剩余H M X浓度，确定菌种对H M X的降解效 率：
n= (C0-C)/C0x l00%〇(1 )式中，n为去除率，%% C。

为初始浓度，mg •L—1;C为 剩余浓度，mg i L-1。

用等量蒸馏水制备的菌悬液，于 590 n m处测定〇D值，以测定其生物量。

同时，了证明球形红细菌可以降解H M X，设置不同体系：分别进行4组平行试验：（1)含有100 m g/L H M X和 球形红细菌的培养基；（2)只含有100 m g/L H M X的培养基；（3)含有100 mg •L-1H M X和灭活球形红细 菌的培养基；（4)在 H M X100 mg •L-1和球形红细菌。

通过接种一定量的球形红细菌，使培养 基中的细菌数量达到1.5X106cells •mL-1。

用橡胶塞将
30 C的光照培养箱中，光照强度为lx 2500。

每隔 12 h 取 2mL 菌液，10000 r •min-1离心 10 m in取上清液。

供氧光照培养条件对菌株生长和降解H M X效率 的影响：按照 的方法， 4种培养条件：厌氧光照、厌氧黑暗、好氧光照和好氧黑暗，光照度为 1x2500,好氧时采用摇床（振荡速度为130 r •m in-1)黑暗（用7层黑 ），培养96h U，取样分析。

不同底物浓度、接种量p H值和温度对菌株降解H M X效率的影响：按照前 的方法，分别考
CHINESE JOURNAL OF ENERGETIC MATERIALS 察不同底物浓度（75，00,25，50 mg •L-1)、接种量 (5°%。

、10°%。

、15°%。

、20°%。

和 25°%。

）和 p H(5、6、7、8 和 9)，
温度（20,25,30,35,40 °C)对菌株降解H M X的效率
的影响及动力学过程。

规定条件为：H M X初始浓度
为100 mg •L1、pH7. 0、接种量为15%。

（体积分)、温度为30 C。

实验过程中，改变1个影响因素，
固定其它3个条件，进而确定适宜降解条件。

2.3测试方法
用UV-2102P C型紫外可见分光光度计（UNICO)在
最大吸收波长50n m处测定菌液浓度（〇DS9_)。

用可见光分光光度法测定H M X的浓度[17]。

3结果与讨论
3.1 球形红细菌H菌株对H M X的降解
球形红细菌H菌株在H M X初始质量浓度为
100 mg •L-1培养基中的生长情况及其降解H M X的
关系如图1。

由图1可以看出，当降解24h，H M X质
量浓度为72.3 mg •L-1，H M X的降解率为30.0%。

；当
降解48h，H M X质量浓度迅速降低为31.3m g•L-1，降
解 68.7%。

；当降解72 h，H M X质量浓度明显降
低，为17.2 mg •L-1,降解率达到82.8%。

随着菌株
进人对数生 （36~72h)，H M X的降解效率显著升
高；之后随着时间的增加，降解效 ，到达
96h时，H M X降解率达到了 88.9%。

分析原因可能
为由 养成分的 和代谢物的 ，菌株生长逐
渐至衰退期，对H M X的降解能力也随之下降，降解曲
线 。

图1球形红细菌生长和降解H M X的曲线
Fig.1 The curves o f Rl^odotihc^r g row th and H M X degradation
四种体系（在培养基中的球形红细菌；只有培养
基的条件；灭活的球形红细菌；在 球形红细
菌）对100 m g.L-1H M X的降解影响如图2所示。

由
含能材料2018年第26卷第4期（
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图2可见，在球形红细菌的作用下可降解H M X ，在 96h 降解率达到88.9%;灭活的H 菌株并未对降解
H M X 产生显著的影响；在只有培养基的对照试验中， H M X 含量也无较大变化。

由此可认为，降解H M X 并
不是由培养基或细胞吸附引起的，降解H M X 主要是 通过球形红细菌的生物降解过程。

由图3可见，H M X 浓度变化对球形红细菌降解HMX 效率的影响十分 。

当H M X 的初始浓度由
75 mg •
升高到100mg • 时，降解速率随着时
间的变化在升高。

初始浓度从1〇〇 mg •
升高到
150 mg • L m 降解速率逐渐随降低。

在初始浓度为 100 mg • L —1时降解效率最佳为88.9%。

在96 h 各浓 度的降解率分别为74.7%。

、88.9%。

、60.0%。

和20.0%〇。

分析原因可能为两种，其一球形红细菌的数量是有限
的，降解效率不会随着H M X 浓度的 直增
[19];其二H M X 在低浓度时可
碳源、氮源，利于
细胞生长，当H M X 浓度进一步升高为150mg • L _1
H 菌株降解H M X 能力大幅度下降，说明过高浓度的 H M X 可能会抑制菌群的生长。

因此选择降解HMX
的最适初始浓度为1 00 mg • L _1。

图3
H M X 不同浓度对降解的影响
Fig.3 Effects o f d ifferent concentrations o f H M X on the degra­
dation
含能材料
www. e nergetic-materials, o rg. •
3.3.2不同接种量对H M X 降解的影响
不同接种量对H M X 降解的影响见图4。

由图4 可见当接种量由5%。

增加到10%。

时，随着时间的增加，
H M X 降解率也随之增加。

当接种量从10%。

增加到
15%。

时，H M X 的降解率上升并在15%。

时达最高，为 88%。

当接种量从15%。

增加到25%。

时，H M X 的降解 率逐渐降低。

分析原因可能
接种量低于10°%。

时，
细胞依靠培养基中的营养成分生长，细胞需要较长时 间来产生大量感应信号分子来满足激活应答的浓度要 求，导致菌株降解H M X 的效率低下。

当接种量从 10%。

到15%。

时，球形红细菌在一定程度上能以HMX 作为其生长的营养成分，进行共代谢。

继续增大接种 量，H M X 降解率基本 定状态，此时接种量已不再是影响H M X 降解率的
因素，这可能由于细菌
群感效应造成的，细胞之间的信息交流与浓度有着密
incubation time / h
图2
不同体系对H M X 降解的影响
Fig.2
Rem oval o f H M X in d ifferent systems
3.2不同供氧光照对H 菌株生长及H M X 降解的影响
在H M X 初始浓度为100mg • L 'p H 值为7,温 度为30°C 和接种量为15%。

的条件下，在96 h 不同的 光照和供氧对球形红细菌的生长和H M X 的降解效果 影响见表1。

由表1可见球形红细菌在不同供氧光照 条件下均可以降解H M X 。

在厌氧光照条件下，96 h 菌株对H M X 的降解率达到最高，为88.9%%且菌体生 最好，O D 值
2.128;其他条件下，96h 菌株对
H M X 的降解率也达到70%。

以上，菌体生长O D 值均
达到1.1以上。

分析原因可能为，球形红细菌在不同 生 下 灵活改变代谢的特性[8]，最适降解条
件 氧光照。

因此选择在厌氧光照的培养条件下进
行降解。

表1
不同光照供氧对H 菌株生长及H M X 降解率的影响
Table 1
Effect o f d ifferent illu m in a tio n a n d o x y g e n supply on
H strain grow th and H M X degradation
Hlu m ination and oxygen *^〇D 590 n m value degradation e ffic ie n c y /%。

anaerobic and ill u m in a tio n 2.12888.9anaerobic and dark
1.23876.5m ic roa e rob ic and ill u m in a tio n 1.78580.6aerobic and dark
1.112
70.4
3.3不同理化条件对球红细菌H 菌株降解H M X 的影响 3.3.1 不同初始浓度对H M X 降解的影响
H M X 在不同初始浓度下对降解的影响见图3。

Chinese Journal of Energetic Materials, Vol.26 , N o.4, 2018 (352~358)
V_.
.6E /
X I A I H 10U 02C 90U O O o
o
o
o
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incubation time / h
图5
不同p H 值对H M X 降解的影响
F ig.5 Effects o f d ifferent pH values on the degradation of
H M X
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incubation time / h
图4
不同接种量对H M X 降解的影响
F i g.4
Eff e c t s o f d iff e re n t i n o c u la ti o n q u a n tit y o n t h e d e g ra d a ­
t i o n o f H M X
3.3.3 不同p H 值对H M X 降解的影响
不同p H 值对H M X 降解效果的影响见图5。

由 图5可见，当p H 值为5.0和9.0时，球形红细菌对
H M X 降解几乎没有作用，p H 值为6.0~8.0，H M X 的
降解率都大于80%，当p H 值为7.0时，96h 菌株H 对H M X 降解
88.9%。

结果表明，厌氧微生物
在p H 值为6.0~8.0时能达到最佳生长条件[21]。

球 形红细菌对p H 值敏感，过酸或过碱的条件都不利于 球形红细菌的生长和对H M X 降解。

分析其原因可能 有两点，其一由于p H 值改变，引起细菌表面电荷改 变，进而影响细菌对H M X 的降解；其二，氢离子浓度 也会影响代谢过程中酶的活性[22]。

p H 值对微生物的 生长代谢
用，能够影响微生物细胞内的酶
活性及代谢产物的生物活性[23]。

所以确定菌群降解
H M X 的最适p H 值是必要的。

因此，降解H M X 的最 佳p H 值为7.0。

3.3.4不同温度对H M X 降解的影响
不同温度对H M X 降解效果的影响见图6。

由 图6可见，在H M X 初始浓度为100mg • L 'p H 值为 7.0，培养96卜
下，当温度为20°C 和40°C 时，球
形红细菌对H M X 的降解几乎没有影响；当温度为 30C 时，降解率可达880%%当温度低于25 C 或者 高于35 C 时，降解率出现了明显的下降。

球形红细 菌降解H M X 的最适温度为30 C 左右。

分析原因可 能是温度与菌株的生
定正相 ，即在适
宜温度条件下，生长较好的菌株产生较多的降解酶，加
子传递。

此外，温度的变化还会引起细胞生存稳 定性的改变[24]。

低温或者高温体系可能会使降解酶 失活甚至变性，进而影响H M X 的处理效果，这可能是 由于环境温度会影响微生物膜的液晶结构、酶及蛋白 质的合成与活性，进而影响微生物的生命活动[25]。

因 此，对于球形红细菌H 菌株降解H M X 的适宜温度是 30~35 C 。

这与屈超[26]等的研究结果一致。

图6
不同温度值对H M X 降解的影响
F ig.6
Effects o f d ifferent tem perature values on the degrada­
tio n o f H M X
3.4 H 菌株对H M X 降解的动力学方程
动力学方程在
物的生物降解研究中被广 泛应用[27]。

本研究选用
动力学模型来模拟对
H M X 降解的动力学过程。

ct/c 0
(2)
式中，c 。

为初始H M X 浓度，mg • L _1 ; ^为f 时刻
H M X 浓度，mg • L M ; f 为降解时间，h ; k 为反应速率
常数，h M 。

方程拟合度由^进行评估。

将不同条件
下动力学 据通过一级动力学模型进行拟合，可
得到不同条件下H 菌株对H M X 降解的动力学方程， 结果见表2。

由表2可看出本试验条件下的降解动力学在一定 程度 合 动力学特征。

随着初始浓度的稳步增加，从75 mg • L 1增加到150 mg • L 1,降解率常数迅
含能材料
2018年
第
26卷
第
4期 （ 352-358)
切的关系，只有当细胞产生的感应信号分子达到一定 浓度的时候，才能激活细胞对环境的应答[20]。

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6E / X S H
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d o u o
o
356赵婷婷，白红娟，康鹏洲，王寿艳
速从0.2405减小到0.0304 h_1，而半衰期从2.9增加到 22.8 h。

当H M X浓度为100 mg •时，速率常数最大，7^2仅为2.5 h;H M X浓度为125 mg •厂1，/^降
低，ア1/2增至5.4h;H M X质量浓度为150m g.L_1时，降解效果出现明显下降，Zc迅速降至0.0340 h1。

结 果也表明，在H M X的生物降解过程中，H M X既是反 应的基质，同时也是抑制剂。

不同接种量下球形红细菌对H M X降解动力学参 数结果见表3。

由表3可见接种量的降解率常数与半 衰期呈相反的变化趋势，接种量从5%15%可以高球形红细菌对H M X的降解率。

在接种量为 15%。

时，降解 最大，7/2是最小。

同样，由不同
p H值下球形红细菌降解H M X的动力学参数结果见表4,当初始p H值从5.0增加到7.0再到9.0,速率常 数从0.0112 h1增加到0.2766 h_1最后下降到0.0115 h—1,半衰期由61. 9 h降至2. 5h再增至44.7 h。

在p H值为7时，速率常数最大，半衰期最小。

可 p H值为7时，降解率最高，说明H M X降 解的最适p H值为7。

由表5可见，当温度从20°C升 高到30°C降解 逐渐增大，在30 C Q， 常最高，30C下降到40 C逐渐减少，速率
明显下降。

当温度为30 C时降解明显。

表 2 H M X在不同初始浓度下球形红细菌降解H M X的动力学方程和动力学参数
Table 2 K inetic equations and kin e tic parameters o f the deg­
radation o f H M X under d ifferent in itia l co n ce ntra tio n by Rhodobacter sphaeroides
initial
co ncentration
/m g•L-
k//-7//R2c=c0e--t
750.2405 2.90.9522c=74.65e_0-2405f
1000.2766 2.50.9908c= 101.23e-0-2766 f 1250.1274 5.40.9617c= 124.52e_0-274f 1500.030422.80.9531c=149.10e-0-0304 f
表3不同接种量下球形红细菌对H M X降解动力学参数
Table 3 K inetic parameters o f the degradation o f H M X under d ife re n t in o c u la tio n q u a ntity by Rhodobacter sphaeroides inoculatio n
q u a n t i t y/0%
—h17//R2c=c0e--k
50.1328 5.20.9784c= 101.23e-0-1328 f 100.1663 4.20.991 6c= 101.23e_0-,663f
150.2766 2.50.9908c= 101.23e-0-2766 f 200.2043 3.40.9832c= 101,23e_0-2043f
250.2165 3.20.9808c=101.2e_0-2,65f 表4不同p H值下球形红细菌降解H M X的动力学参数
Table 4Kinetic parameters o f the degradation o f H M X under
d ifferent in itia l pH by Rhodobacter sphaeroides
pH value—h-
5.00.0112
6.00.2680
7.00.2766
8.00.2826
9.00.0155
7//R2
6190.9240
260.9804
250.9908
240.9851
4470.9007
—
c=101.23e_0J12t
c=101.23e_02680t
c=101.23e_0-2766
c=101.23e_0-2826
c=101.23e_0-0155t
表5不同温度下球形红细菌降解H M X的动力学参数
Table 5 Kinetic parameters o f the degradation o f H M X under
d ifferent tem peratur
e by Rhodobacter sphaeroides
T/C—h-T//R2c=c0e-—
200.023861.90.9270c=101.23e_0.238t
250.1 570 3.60.9945c=101.23e_01570t
300.2766 2.50.9908c=101.23e_0-2766t
350.1 653 3.00.708c=101.23e_0-,653t
400.016844.70.9567c=101.23e_0-0,68t
4结论
(1) 驯化后的光合细菌球形红细菌H菌株具有较
高的细胞活性，能高效降解H M X。

该菌株在不同供氧
光照条件下均可以降解H M X，但是，在厌氧光照条件 下，降解最佳。

H菌株降解HMX通过球形红
细菌的生物降解过程。

(2)初始H M X浓度、接种量、p H值和温度对
H M X降解效果有不同程度的影响。

该菌株降解HMX
的最适条件为：在厌氧光照的条件下，初始浓度为
100 mg •L—1、pH 7.0、接种量为15%。

和温度为30C，
H M X的降解率达到88.9°%。

(3) 在初始浓度为75 ~ 150 mg •L—1、接种量为5°%~25°%、p H值为5~9,20~40°C，光合细菌球形红
细菌降解H M X的规律符合 动力学方程。

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a t u r e o n t h e d e g r a d a t i o n a
b i l i t y o f H M X b y d o m e s t i
c a t e
d Rhodobacter sphaeroides H s tr a in w
e r e s t u d i e d.Its k i n e t i c e q u a t i o n o f
d e g r a d a t i o n w a s f i t t e d a n d a n a l y z e d.T h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r t h e d e g r a d a t i o n o f H M X b y Rhodobacte r sph a e r oides w e r e d e t e r­
m i n e d b y c h a n g i n g o n e i n f l u e n c i n g f a c t o r a n d f i x i n g t h e o t h e r f o u r c o n d i t i o n s.T h e c o n c e n t r a t i o n o f H Rhodobacter sphaeroides w e r e m e a s u r e d b y a s p e c t r o p h o t o m e t e r.T h e re s u lts s h o w t h a t d o m e s t i c a t e d Rhodobacter sph a eroides c a n
e f f i c i e n t l y d e g r a d e H M X，R h o d o b a c t e r s p h a e r/'d e s H s tr a in c a n g r o w c o m m e n d a b l y a n d d e g r a d e H M X u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s
o f o x y g e n s u p p l y a n d i l l u m i n a t i o n，a n d t h e d e g r a d a t i o n ra te r e a c h e s m o r e t h a n70%.T h e b e s t d e g r a d a t i o n c o n d i t i o n is a n a e r o b i c
i l l u m i n a t i o n. T h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r t h e d e g r a d a t i o n o f H M X a r e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n o f100m g•L-，p H=7，i n o c u l a t i o n
q u a n t i t y o f15%〇a n d t e m p e r a t u r e o f30°C , t h e d e g r a d a t i o n ra te o f H M X is t h e h i g h e s t,r H M X b y Rhodobacter sph a eroides is c o n s i s t e n t w i t h t h e f ir s t o r d e r k i n e t i c e q u a t i o n.
Key w o rd s：o c t o g e n( H M X) ；Rhodoba c t e r s ph a ero i des;m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n；k i n e t i c e q u a t i o n
CLC n u m b e r：TJ55；X172D o c u m e n t c o d e：A D O I：10.11943/j.i s s n.1006-9941.201 8.04.011 Chinese Journal of Energetic Materials，V ol.26，N o.4，2018 (352-358)含能材料www. e nergetic-materials, o rg. c n。