微工第4章柠檬酸发酵机制
柠檬酸
建国以来柠檬酸发酵工业回顾一、行业简介1、行业的历史柠檬酸的研究和生产已有300年的历史。
早在1784年，瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸。
1838年，由Liebig鉴定出它是一种含有一个羟基的三元酸。
随后，在1860年意大利开始从果汁中用添加石灰乳的办法得到柠檬酸，从而进行了工业化生产。
到1913年,Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸。
1916年，美国农业部华盛顿化学局微生物研究室主任Thom和同事Currie对黑曲属的许多菌株进行过普查，发现很多菌种能产柠檬酸。
1919年，比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法生产柠檬酸。
1923年，美国Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸。
1938年，Perquin在荷兰发表论文，他将黑曲霉培养于低pH的含硫酸锌、氯化钾和氯化铵的糖溶液中获得了一些柠檬酸，对深层培养法的pH控制，提出了有力的证据。
1944年，Szucs应用纯蔗糖，在9d内发酵柠檬酸，可得到92%的产率，但因时间太长，未能投产。
1952年，Buelow和Johnson等用150g/L蔗糖培养液通入无菌空气，通气量增加，柠檬酸发酵时间可缩短，这对柠檬酸发酵条件控制，有了进一步地认识。
1952年，美国Miles公司，首先成功地采用深层发酵法工业化规模生产柠檬酸。
解放前我国柠檬酸工业是个空白. 20世纪60 年代, 天津工业微生物研究所、上海工业微生物研究所首次采用木薯为原料发酵生产柠檬酸, 并筛选培育出优秀的耐高糖、耐高柠檬酸并具抗金属离子的黑曲霉高产柠檬酸菌株, 成功实现了产业化。
1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。
为我国有机酸产业的形成与发展奠定了基础。
而后, 两个研究所又不断推出适合不同原料的高产菌株和新配方, 使浓醪高发酵指数的深层发酵工艺不断完善, 全行业通过积极引进和消化国内外先进技术和装配, 不断进行自主创新, 形成了具有中国特色的浓醪高发酵指数的深层发酵新工艺, 使得中国很快在20世纪末变成柠檬酸生产大国。
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制
上海工微所 东酒2号 N-588 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率19%，转化率 97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工 所），产酸14%，生长特性粗放，抗金属离子能力强， 以甘蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
葡萄糖： r-130 薯渣固态发酵： G2B2, 川柠1-1，Co827，T419
• 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬 酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋 向于合成柠檬酸，而柠檬酸分解活力低，一旦柠檬酸浓 度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从 而进一步促使柠檬酸的自身积累，PH降至2.0以下，顺乌 头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的 积累并排出体外。
丙酮酸激酶（PK）
• 变构酶 • 1,6-二磷酸果糖活化 • ATP和丙氨酸抑制 • 受柠檬酸或ATP抑制 • 被NH4+ ，K+激活
• 丙酮酸脱氢酶系的调节
• ATP/ADP,NADH/NAD+
• 产物抑制 • 乙酰COA，NADH抑制酶活性，
COASH,NAD+解除抑制 • 能荷调控 • GTP抑制，AMP活化
• 由于严格限制供给锰离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑 制，使EMP途径的代谢流增大。
和线粒体中的依赖于NAD+的异柠檬酸脱氢酶均表达下调。
2020407 思考题
• 黑曲霉柠檬酸发酵过程中为什么控制MN2+浓度，与柠檬酸合成过程中 的酶调控有什么关系，请阐述机理。
• MN2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，当培养基中MN2+缺乏时，微生 物体内积累几种氨基酸(GA、GLU、ARG、OIN等)，这些氨基酸的积 累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。 NH4+能有效 的解除柠檬酸、ATP对PFK酶的抑制作用
《柠檬酸发酵》课件
柠檬酸发酵的未来发展
生物技术进步
随着生物技术的不断发展，未来有望通过基因编辑和合成 生物学手段进一步提高柠檬酸发酵的产量和效率。
环保要求
随着环保意识的增强，开发低污染或无污染的柠檬酸发酵 工艺将成为未来研究的重要方向。
智能化发酵
借助物联网、大数据和人工智能等技术，实现柠檬酸发酵 过程的智能化监控和管理，提高生产效率和产品质量。
无水硫酸铵
作为氮源，提供菌种生长所需的氮元素。
玉米浆
含有丰富的维生素、氨基酸和生长因子，有 助于菌种的生长和代谢。
磷酸二氢钾
提供磷元素和钾元素，有助于菌种的正常代 谢。
菌种接种与发酵
菌种选择
选择高产柠檬酸的菌种，如黑曲霉、 青霉等。
接种量
根据发酵罐的大小和生产能力，确定 适宜的接种量，以保证发酵效率。
在缺氧条件下，菌体会进行厌氧呼吸，产生乳酸或乙醇等副产物，而不是柠檬酸 。因此，需要提供足够的氧来支持菌体的有氧代谢，从而获得高产量柠檬酸。
营养物质对柠檬酸发酵的影响
营养物质是柠檬酸发酵过程中的基础物质，包括碳源、氮源 、磷源和无机盐等。
不同的营养物质对柠檬酸发酵的影响不同。通过实验研究， 可以确定最佳的营养物质配比，以提高柠檬酸的产量。此外 ，添加一些生长因子或酶抑制剂也可以调节菌体的代谢途径 ，从而影响柠檬酸的产量。
柠檬酸发酵的控制策略
参数控制
通过控制温度、pH、溶氧浓度等关键 参数，保证发酵过程在最佳条件下进行
。
分离纯化
采用高效的分离纯化技术，如离子交 换、吸附、萃取等，将柠檬酸从发酵
液中提取出来。
补料控制
根据发酵过程的实时监测数据，适时 添加必要营养物质，避免因缺乏某些 关键成分而影响发酵。
第4章 发酵工程
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
3）产物促进剂
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物， 又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
5、水
三 发酵的一般过程
配制
灭菌
培养基原料
接种
培养基
灭菌 灭菌 接种 发酵
菌种
摇瓶
扩大
种子罐
生产罐
培养液
分 离
产品抽提、精制
上清液
菌体
1 菌种 2.种子扩大培养 斜面菌种活化 →一级种子培养（摇瓶）
环境
环境
合成产物的前体
合成副产物
从检测手段分可分为：直接参数、间接参数
发酵过程变化的参数
直接参数:温度、 pH、溶解氧 浓度、压力、发酵液粘度等；
间接参数:细胞生长速率、产物 合成速率和呼吸熵等。
1 温度
(1) 温度对生长的影响
根据微生物对温度的要求大致可分为四类：
在最适温度下，微生物生长迅速；
• 1680年,荷兰的列文虎克(Anthony Leeuwenhoek)制成了 显微镜,并通过显微镜观察到了微生物.
•
19世纪中期，法国的巴斯德（Louis Pasteur)证明了酒 精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由 不同的微生物产生的。
德国的柯赫（Robert Koch)发明了固体培养基，得到了 细菌的纯培养物，由此建立了微生物的纯培养技术。
（ 1 ）调节好基础料的 pH ，基础料中若含有 玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。 （2）在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ， 或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等 （3）通过补料调节pH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。 在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH （4）当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH
微生物工程工艺原理第四章柠檬酸发酵机制
4、All that you do, do with your might; things done by halves are never done right. ----R.H. Stoddard, American poet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行6.17.20216.17.202110:5110:5110:51:1910:51:19
第二篇 发酵机制
3. α-酮戊二酸脱氢酶：黑曲霉α-酮戊二酸 脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。
第四章 柠檬酸发酵机制
第二篇 发酵机制
第四章 柠檬酸发酵机制
磷酸烯醇丙糖
CO2
CO2
丙酮酸
乙酰CoA
CO2 草酰乙酸
柠檬酸
苹果酸
Fe2+ 顺乌头酸
富马酸
异柠檬酸
琥珀酸
Α-酮戊二酸
Α-酮戊二酸脱氢酶
第二篇 发酵机制 二、柠檬酸生物合成的代谢调节
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1.铵离子能够解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖
激酶的抑制作用，对该酶表现出激活作用； 铵离子的浓度与柠檬酸生成速度、积累有密 切关系，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬 酸产量；
9、要学生做的事，教职员躬亲共做； 要学生 学的知 识，教 职员躬 亲共学 ；要学 生守的 规则， 教职员 躬亲共 守。21.7.1421.7.14Wednesday, July 14, 2021 10、阅读一切好书如同和过去最杰出 的人谈 话。01:15:5601:15:5601:157/14/2021 1:15:56 AM 11、一个好的教师，是一个懂得心理 学和教 育学的 人。21.7.1401:15:5601:15Jul- 2114-J ul-21 12、要记住，你不仅是教课的教师， 也是学 生的教 育者， 生活的 导师和 道德的 引路人 。01:15:5601:15:5601:15Wednesday, July 14, 2021 13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成 。21.7.1421.7.1401:15:5601:15:56Jul y 14, 2021 14、谁要是自己还没有发展培养和教 育好， 他就不 能发展 培养和 教育别 人。2021年7月 14日星 期三上 午1时15分56秒01:15:5621.7.14 15、一年之计，莫如树谷；十年之计 ，莫如 树木； 终身之 计，莫 如树人 。2021年7月上 午1时15分21.7.1401:15Jul y 14, 2021 16、提出一个问题往往比解决一个更 重要。 因为解 决问题 也许仅 是一个 数学上 或实验 上的技 能而已 ，而提 出新的 问题， 却需要 有创造 性的想 像力， 而且标 志着科 学的真 正进步 。2021年7月14日星期 三1时15分56秒01:15:5614 July 2021 17、儿童是中心，教育的措施便围绕 他们而 组织起 来。上 午1时15分56秒 上午1时15分01:15:5621.7.14
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1.首先，选择适当的黑曲霉菌种作为发酵的起始种。
First, choose the appropriate Aspergillus Niger strain as the starting culture for fermentation.2.将黑曲霉菌种接种到含有适量碳源和氮源的发酵基质中。
Inoculate the Aspergillus Niger strain into a fermentation medium containing suitable amounts of carbon and nitrogen sources.3.确保发酵基质的pH值在合适的范围内，通常为3.0至6.0。
Ensure that the pH of the fermentation medium is within the appropriate range, typically between 3.0 and 6.0.4.控制发酵温度在25°C至35°C之间，提供适宜的温度条件。
Control the fermentation temperature between 25°C and 35°C to provide suitable conditions for growth.5.确保发酵过程中的通气充足，以促进微生物的生长和代谢活动。
Ensure adequate aeration during the fermentation processto promote microbial growth and metabolic activity.6.在发酵过程中定期监测黑曲霉的生长情况和产酸量。
Regularly monitor the growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid during the fermentation process.7.当黑曲霉的生长达到高峰并且产酸量稳定时，进行收获。
微生物发酵制柠檬酸论文
柠檬酸合成酶是TCA环的起始酶，只对CoA和ATP的调节敏感，ATP-Mg螯合物只起微弱的抑制作用，而其它调节物则无影响，因细胞内ATP是以Mg螯合物形式出现，所以ATP对他影响不太重要，该酶对乙酰CoA的亲和力取决于草酰乙酸的浓度，在柠檬酸积累条件下会使该酶对乙酰CoA亲和力增强。
1.磷酸果糖激酶（PFK）活性调节
在黑曲霉的EMP途径中，PFK是个调节酶，是柠檬酸合成中的主要调节点。在正常生理条件下，该酶被柠檬酸和ATP抑制，而被无机磷、AMP和铵离子激活，铵离子的存在可有效地解除PFK对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使PFK不受柠檬酸的抑制，则必须变更营养成分的限制与氧的供给。
发酵微生物：
能够产生柠檬酸的微生物有很多，在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母和涎沫假丝酵母，但在工业生产上，以糖质或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属，有黑曲霉、泡盛酒曲霉、米曲霉、灰绿曲霉最为重要，特别是黑曲霉。
微生物的育种：
（1）为提高葡萄糖进入细胞的代谢活力，进一步增强EMP的代谢流，采用60Coγ射线或EMS等诱变剂诱变育种（致死率为70%-80%）。通过高糖（蔗糖）14%的培养基平板筛选分离出比原株生长更好的突变株，有可能获得己糖激酶和6-磷酸果糖激酶活性更高的菌株；在纤维二糖培养基的平板筛选具有2-脱氢葡萄糖抗性的突变株，有可能获得以淀粉为原料的高产柠檬酸突变株；亦可进一步选育抗金属锰离子、锌离子能力强的突变株。
（2）为降低副产物有机酸如葡萄糖酸和草酸的能力，采用基因工程的手段，构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失的工程菌。
生物合成途径：
普遍认为柠檬酸糖质原料发酵是经EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环而形成的。
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢。虽然也存在HMP酶系，但HMP途径主要在孢子阶段活跃，应为它提供了核酸合成等所需的前体物质。Shu的研究表明约有40%的柠檬酸是通过柠檬酸循环中的二羧酸形成的。Cleland等则认为TCA循环受到强烈干扰。还有一种意见认为，当乌头酸酶和异拧香酸脱氢酶消失时，就出现柠檬酸。而有人却证明柠檬酸酶或需要NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶受到阻断。从黑曲霉的老菌丝体中分离的线粒体可以看到，在柠檬酸大量形成时，TCA循环中其呼吸作用略有减弱。因此可以证明，在柠檬酸形成的主要阶段，存在着乌头酸酶、需NAD和NADP的异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、富马酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，并对α-氧-戊二酸脱氢酶有抑制作用。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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柠檬酸 工艺流程图
柠檬酸工艺流程图柠檬酸是一种常见的酸味食品添加剂，也常用于制备柠檬饮料、调味料以及药物。
下面是柠檬酸的工艺流程图。
柠檬酸的制备主要有两种方法，一种是通过微生物发酵，另一种是通过化学合成。
在这里，我们将介绍微生物发酵方法。
1. 选材和预处理首先，我们需要选择适当的原料，通常是柠檬或其他柑橘类水果。
将柑橘类水果洗净、去皮、挤汁，得到柠檬汁。
2. 发酵液的配制将得到的柠檬汁加入培养基中，培养基中含有适当的碳源和氮源，以及其他必需的营养物质。
将培养基搅拌均匀。
3. 发酵罐的准备将培养基倒入发酵罐中，注意不要超过一定的液位。
发酵罐内通入适量的空气或氧气，保证微生物的正常生长和酸化反应。
4. 发酵过程添加发酵菌种，通常是柠檬酸菌或酵母菌，使其在一定的温度、pH和氧气条件下进行发酵。
发酵过程中，微生物会将柠檬汁中的糖分解为柠檬酸和二氧化碳。
5. 酸化反应发酵完成后，将发酵液倒入反应罐中，调整pH值为适当的范围。
然后，通过加热和搅拌，将反应温度提高到一定的范围，促使柠檬酸的析出。
6. 结晶和分离将发酵产生的柠檬酸溶液冷却，并持续搅拌，使得柠檬酸结晶出来。
通过离心或过滤，将结晶的柠檬酸与溶液分离。
7. 干燥和粉碎将分离得到的柠檬酸晶体放入干燥箱中，进行干燥，去除多余的水分。
然后，将干燥后的柠檬酸晶体粉碎，使其成为细小的颗粒。
8. 包装和质检最后，将粉碎好的柠檬酸颗粒装入包装袋中，并进行质量检查。
确保产品符合食品安全标准，并符合相关的质量指标。
这就是柠檬酸的工艺流程图。
通过适当的选材和预处理，发酵液的配制，发酵过程和酸化反应，接着进行结晶和分离，最后进行干燥和粉碎，得到最终的柠檬酸产品。
这一系列的工艺步骤确保了柠檬酸的高纯度和质量，可以广泛应用于食品和药物制备中。
柠檬酸的生产工艺
柠檬酸的生产工艺柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、化妆品等领域的有机酸，具有酸味和清香的特点。
以下是柠檬酸的生产工艺的简要介绍。
柠檬酸的主要生产工艺包括传统工艺和现代工艺两种。
传统工艺:传统工艺主要以柠檬或柠檬皮为原料进行发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 预处理: 将柠檬或柠檬皮去皮、去籽，然后切碎或研磨成泥状。
2. 发酵: 将柠檬泥放入发酵罐中，加入一定比例的细砂糖和水，并加入适量的发酵剂，如酵母、酒石酸盐等，进行发酵。
发酵温度一般控制在30-35摄氏度，发酵时间约为2-3天。
3. 分离: 发酵后的混合物经过滤去除固体残渣，得到柠檬酸浸提液。
4. 浓缩: 柠檬酸浸提液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
5. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
6. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
现代工艺:现代柠檬酸生产工艺主要采用微生物发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 选种培养: 选用高产柠檬酸的微生物，如亚洲真菌、微生物菌株等进行培养和选种。
2. 培养基制备: 通过混合培养基原料，如糖、酵母粉、蛋白胨、盐等，制备培养基。
3. 发酵: 将选好的微生物种子培养液接入发酵罐中，加入培养基和适量的营养物质，如氮源、磷源、微量元素等，进行发酵。
发酵温度和时间一般根据菌株的要求进行控制。
4. 分离: 将发酵液经过滤或离心分离，得到柠檬酸发酵液。
5. 浓缩: 将发酵液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
6. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
7. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
以上是柠檬酸生产的主要工艺流程，不同生产厂家可能会有一些细微的差异和改进。
现代工艺相对于传统工艺而言更加高效、可控性更强，并且可以实现大规模连续生产，提高了生产效率和产品质量。
《柠檬酸发酵机制》课件
发酵在食品、饮料、药品和生物能源等领域具有重要的应用价值。
柠檬酸发酵的概述
柠檬酸
柠檬酸是一种有机酸，广通过微生物参与的发酵过程产生，这个过程复杂 而多样。
柠檬酸发酵的微生物参与者
1 Aspergillus niger
这个真菌物种可以产生大量的柠檬酸，并被广泛用于柠檬酸生产。
2 Yarrowia lipolytica
这个酵母菌也具有较高的柠檬酸产量，适用于工业规模生产。
柠檬酸发酵的反应过程
1
底物准备
选择适合的有机物作为柠檬酸发酵的底物。
2
发酵培养
将底物与适宜的微生物共同培养，提供适宜的温度和氧气条件。
3
柠檬酸生成
底物被微生物分解，生成柠檬酸和其他副产物。
柠檬酸发酵的影响因素
温度
适宜的温度可以促进柠檬酸生成的速率和产量。
营养物质
提供足够的营养物质，如糖类、氮源和微量元素， 有助于增加柠檬酸产量。
pH 值
不同微生物对 pH 值的要求不同，酸碱度对柠檬酸 发酵具有影响。
氧气供应
有些菌株需要适量的氧气参与发酵过程，而有些则 能在无氧条件下进行发酵。
柠檬酸发酵的应用领域
食品生产
柠檬酸在食品加工中用作风味调剂 剂和酸味调节剂。
药品工业
柠檬酸被用作制药过程中的溶剂和 酸化剂。
清洁剂生产
柠檬酸被用于生产清洁剂，具有溶 解和去污的作用。
结论和总结
1 柠檬酸发酵在许多领域具有广泛的应用 2 微生物是柠檬酸发酵的关键参与者
柠檬酸发酵技术在食品、医药和清洁剂等行业有 着重要的地位。
不同的微生物物种对柠檬酸发酵具有不同的产量 和效率。
《柠檬酸发酵机制》PPT 课件
《柠檬酸发酵机制》课件
厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。
柠檬酸
问题：产酸略低；提取比率比国际先进水平低8%-15%；生产 中的“三废”未有效治理。
二、柠檬酸发酵微生物
1、黑曲霉 ( Aspergillus niger )
目前最有竞争力的菌种，我国多数厂家采用
2、酵母
酵母的重要性在于能发酵烷烃产生柠檬酸
解脂假丝酵母( Candida lipolytica )
三、柠檬酸发酵机理
（二）柠檬酸的用途
1、在食品工业上的应用：占70% 第一食用酸味剂 2、在医药上的应用 广泛用于糖果、饮料、果酱、果胨、果酒、腌制品、罐头、糕点等 柠檬酸糖浆：发烧病人的清凉饮料，清凉、解毒、矫口味 3、在化工上的应用 赋予水果风味，抗氧化、保护色素和维生素，使产品新鲜感等 柠檬酸铁铵：温和的补铁剂，用于缺铁性贫血 常用的电镀缓冲剂和络合剂 柠檬酸钾：治疗膀胱炎和糖尿病所致的酸中毒 多年来，世界柠檬酸消费增长速度始终维持在5%-7%，用途也 许多化学反应的催化剂：如环氧树脂的交联、聚尿烷泡沫塑料 在不断扩大中。 柠檬酸钠：抗凝血剂，用于输血、血液和血浆的保存 用于制造高效无公害洗涤剂 柠檬酸铜：消毒杀菌剂并有收敛作用，用于配制眼膏 用于生产牙膏、洗面乳、洗发剂 柠檬酸镁：温和的泻药，用于X光透视前的清肠
Sweet potato
cassava
2、制种
我国普遍采用麸曲生产工艺 流程： 原种 斜面 茄瓶 麸曲 种子罐
麸皮培养基；三角瓶或可拆卸铝盒 使孢子发育成菌丝球；缩短发酵罐的发酵时间； 茄瓶孢子接种； 30～32℃，4 d 薯干粉培养基；麸曲接种； 34～35℃，18～28h
3、发酵
设备类似酱油厚层制曲池。
糖质原料生物合成柠檬酸的途径
1 2 3
柠檬酸虽在TCA循环中是一个中间产物，但在正常情况下，柠 檬酸在细胞内不会积累，且柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。
简明微生物工程 发酵机制酒精柠檬酸PPT课件
概 * 念
—通过 HMP途径的发酵
葡萄糖发酵除产生乳酸外还有
CO2 、乙醇或乙酸。
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i)
异
型
肠膜明串 珠菌属
乳
利用葡萄
糖的反应
酸
发
酵
经
典
途
径
转化率50％
短乳杆菌利用核糖 的反应
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ii ) 双 歧 杆 菌 途 径
50％
净5个
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同型、异型乳酸发酵比较
2、由于丙酮酸羧化酶组成型，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸。－－原料充足
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黑曲酶的标准呼吸链和侧系呼吸链
NADH2 琥珀酸
水杨酰异羟 肟 酸 X
侧系呼吸链
O2
黄素蛋白 Y
细胞 色素b
细胞 色素c
抑菌素抑制
细胞 色素a、
a3
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EMP途径的磷酸果糖激酶是一种调节酶。
1、正常情况，无氧生成乙醇 2、加入抑制剂（NaHSO3),形成甘油—二型发酵
3、抑制剂不可太多，否则中毒，因此仍有乙醇 4、碱性（ pH7.6 ）条件下，乙醛歧化，产生甘油、乙
醇、乙酸、CO2 ——酵母的三型发酵
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四、乳酸发酵机制
1、同型乳酸发酵：产物只有乳酸 NADH NAD+
葡萄糖==========〉丙酮酸 ==========〉乳酸
1mol葡萄糖按100%生成2mol乳酸，乳酸对糖 的理论转化率：
2*90/180 *100% =100 %
： 进 行 同 型 乳 酸 发 酵 的 M
保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、
柠檬酸
主要内容
一、柠檬酸生产的历史 二、 柠檬酸发酵微生物 三、柠檬酸生物合成途径 四、柠檬酸发酵工艺 五、柠檬酸提取
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南京师范大学金女院
1
柠Hale Waihona Puke 酸 柠檬酸(Citric acid)，又名枸橼酸，分子式为 C6H8O7。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无 臭，具有令人愉快的强烈的酸味，相对密度为 1.6550。柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、 氯仿等有机溶剂。柠檬酸是生物体主要代谢产物 之一。
异柠檬酸脱氢酶
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南京师范大学金女院
13
1、磷酸果糖激酶（PFK）
NH4+激活PFK的活性，ATP抑制PFK活性。
研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生 长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可 达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生 物体内NH4+浓度升高，使得葡萄糖源源不断的合 成大量的柠檬酸。
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柠檬酸生产工艺
液体发酵法
液体表面发酵法 液体深层发酵法
固体发酵法
薄层发酵法 厚层发酵法
曲醅厚度
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南京师范大学金女院
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固态发酵
固态发酵是以薯干粉、含淀粉的农副 产品为原料，配好培养基后，在常压 下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲， 装入曲盘，在一定温度和湿度条件下 发酵。
柠檬酸的上清液中加人CaCO3或Ca(OH)2中和， 使柠檬酸生成柠檬酸钙沉淀
固液分离后，柠檬酸钙再用硫酸酸解，生 成柠檬酸水溶液
再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提 取液进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固 体产品．
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3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是， α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此 当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可 逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：① TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆 TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二 酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
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第四章 柠檬酸发酵机制
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
2014-2-20 ‹#› 第四章 柠檬酸发酵机制
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
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第四章 柠檬酸发酵机制
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。 但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产 厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化 学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚 柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物 药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在 以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环 被阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由 丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。 即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用 下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
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第四章 柠檬酸发酵机制
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分子 乙酰辅酶A，也就是需要1.5 分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
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第四章 柠檬酸发酵机制
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利 用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
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第四章 柠檬酸发酵机制
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
1940年，Krebs: TCA；
1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途 径所有酶；
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2. 显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
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第四章 柠檬酸发酵机制
3. 不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后 续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。 4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使 TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。 （为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
石油（石蜡油）解脂假丝酵母 50%提高至80% 固定化细胞循环生物反应器发酵技术 每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜，2.2～2.3t薯干粉或1.2～ 1.3t蔗糖。人们正在大力开发
第四章 柠檬酸发酵机制
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三、我国柠檬酸生产现状 生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉 中存在TCA循环。
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二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
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第四章 柠檬酸发酵机制
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡 萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化 脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙 酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。
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第四章 柠檬酸发酵机制
思考题
1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如 何控制？
2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率 的意义。
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第四章 柠檬酸发酵机制
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
2014-2-20 ‹#› 第四章 柠檬酸发酵机制
（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸
乙醇乙酸
3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为异 柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃发 酵，低浓度AMP抑制NAD异柠檬酸脱氢酶的活性，柠 檬酸大量合成并积累。此时 顺乌头酸水合酶催化反应平 衡为：柠檬酸：异柠檬酸： 顺乌头酸 = 90：7：3。细 胞质中积累大量异柠檬酸。
毛孔的收细，黑头的溶解
Ø饲料业：可以提早断奶，提高饲料利用率5%～10%，增加母猪产仔量 Ø环保：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液用于烟气脱硫
2014-2-20 ‹#› 第四章 柠檬酸发酵机制
从柑橘提取
固态发酵（薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品 ） 液态浅盘发酵（黑曲霉，泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉 ） 深层发酵（黑曲霉/薯干粉 ）
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第四章 柠檬酸发酵机制
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产生 ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙 酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强 了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱 氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
第四章 柠檬酸发酵机制
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第四章 柠檬酸发酵机制
重点：柠檬酸生物合成途径 柠檬酸生物合成的代谢调节机制 难点：柠檬酸生物合成的代谢调ห้องสมุดไป่ตู้机制
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第四章 柠檬酸发酵机制
第一节 概述
一、柠檬酸简介
柠檬酸又名枸橼酸（ jǔ yuán suān），学名α-羟基丙烷 三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基 丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微 溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
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第四章 柠檬酸发酵机制
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水
合酶失活。
2014-2-20
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第四章 柠檬酸发酵机制
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第四章 柠檬酸发酵机制
二、柠檬酸及其盐的应用概况
Ø食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、防腐剂， 除腥脱臭剂； Ø医药工业：枸橼酸根离子与钙离子能形成一种难于解离的可溶性络合
物，因而降低了血中钙离子浓度，使血液凝固受阻。在输血或化验室血样抗凝 时，用作体外抗凝药
Ø化学工业：鳌合剂 ，迅速沉淀金属离子 Ø美容品、化妆品：加快角质更新，有助于皮肤的中黑色素的剥落，
2014-2-20 ‹#› 第四章 柠檬酸发酵机制
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
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第四章 柠檬酸发酵机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基 酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味 着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不 受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。