柠檬酸发酵机制

来源
• 天然柠檬酸存在于柑桔、柠檬、菠萝、无花果等 果实内。 • 制造柠檬酸的方法有三种 • （1）合成法 • （2）自果实中提取 • （3）发酵法 • 由于合成法成本高, 而从果实中提取又受季节性和 地区性的限制, 所以各国多采用发酵法制造柠檬酸。
黑曲霉简介
• 黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢 科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世 界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的 发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲 霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬 酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从 土壤中分离培养，土壤来源有要求。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是 由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积 累的大量柠檬酸不敏感。
淀粉
葡萄糖 6-磷酸果糖
Pi AMP ATP
1，6-二磷酸果糖
NH4 +
磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2 乙酰CoA 柠檬酸
K
+
CO2 草酰乙酸
丙酮酸 CO2
• 2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最 大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成） 代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。
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氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。
磷酸烯醇式丙糖酸 CO2 草酰乙酸 苹果酸 富马酸 琥珀酸 丙酮酸
CO2
CO2 乙酰CoA 柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸 α -酮戊二酸 Fe 2+
α -酮戊二酸脱氢酶系
抑制
TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳 为：
• （1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键
• 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80％走 EMP途径； • 1958年，MeDomough等发现黑曲霉还存在 HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于孢子形 成阶段； • 1954－1955年，Ramakrishman和Martin研 究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
柠檬酸的发酵机制
BY 白云仙 吴雪琴 廖文翡 邵文博 杨亚蓝 吕 佩 纪星浩
CONTENTS
• • • • 概述 柠檬酸的生物合成途径 柠檬酸生物合成的代谢调节 柠檬酸的积累机制归纳
一、概述
• 柠檬酸又名枸 橼酸，学名α羟基丙烷三羧 酸，是生物体 主要代谢产物 之一。
性质： 分子式C6H8O7，分子量192.12 有两种形式 水合物：100℃时融解，密度 1.542g/cm3(18℃) 无水物：无色晶体或粉末，熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚
•
碳平衡和能量平衡
9ADP 9ATP
3/2O2
3H2O
பைடு நூலகம்
2ADP
2ATP
2H2
C6H12O6 丙酮酸脱羧 CO2固定 C4C2缩合
EMP途径
2×C3H4O3
C6H8O7
柠檬酸
H2O
三、柠檬酸生物合成的代谢调节
• （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
• 1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有 抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有 激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果 糖激酶的抑制作用。
而使pH值降低。
• 2.第二个特点：黑曲霉菌体内α -酮戊二酸脱氢酶缺失
或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋ 抑止 。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤）
• 3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 • 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的 NADH2重新氧化时所需
• 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺
1，6-二磷酸果糖 磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2 乙酰CoA 柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸
琥珀酰CoA
CO2 草酰乙酸 苹果酸 延胡索酸
丙酮酸
CO2
Fe 2+
琥珀酸
α -酮戊二酸
• 黑曲霉中存在两个CO2固定系统（需 Mg2＋、K＋）： • 1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作 用下，生成草酰乙酸（此作用更强） 2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激 酶的作用下，生成草酰乙酸
四、柠檬酸的积累机制归纳：
① Mn2+缺 乏 抑制蛋 白合成 NH4
+
有一条呼吸活力强的不产生ATP 的侧系呼吸链
解除磷酸果糖激酶 的代谢调节，促进 EMP途径的畅通
② 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。
③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反 应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了 合成柠檬酸的能力。
• （2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代
谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应
的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的
合成能力
•
（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环 中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡 状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超 过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱 氢酶活力来提高自身的积累。
国内生产历史
• 1968年我国在黑龙江省和平糖厂建立第一 个生产车间，以甜菜糖蜜为原料浅盘发酵 生产柠檬酸，年产量100t。 • 1969年上海酵母厂在50m3罐上实验成功， 利用淀粉为原料进行深层发酵生产柠檬酸。 • 上世纪90年代，我国只有5家50kt/年以上柠 檬酸生产能力厂家，年生产力不足40万t， 目前全国柠檬酸生产能力已达60万t以上， 大小厂家500多个，已成为世界上最大柠檬 酸生产国和出口国。 • 2005年，柠檬酸产量产品63万t，占世界总 产量的44%。
•
锰缺乏时，细胞内NH4＋ 浓度高，Aa浓度高 （蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子 效应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果
糖激酶的抑制来实现的。
• 3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某
些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。
（二）TCA循环的调节
•1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。
生产历史
• 1784年瑞典化学家 Scheel 首次从柠檬汁中 提取出柠檬酸，并制成结晶。 • 1913年 Zahorski 首先利用黑曲霉生产柠檬酸。 • 1919比利时一家工厂成功的利用浅盘发酵 法实现了柠檬酸的工业化生产。 • 1952年美国 Miles 实验室公司采用深层发酵 法大规模生产柠檬酸获得成功，促进了柠 檬酸工业的发展，2005年世界柠檬酸产量 达到140万t左右。
但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是
黑曲霉TCA环的第一个特点。
• 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必 要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、 异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在 催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累
用途
摄影 建筑 塑料 铸造 陶瓷
酸味剂
增溶剂
抗氧化 剂
皮革
柠檬 酸
食品
除腥脱 臭剂
石油 纺织 电子 饲料 化工
医药
风味增 进剂
脱凝剂
调色剂
二、柠檬酸的生物合成途径
氧化脱羧 葡 萄 糖 EMP途 径 丙 酮 酸
羧化
乙酰CoA 草酰乙酸
柠 檬 酸
黑曲霉发酵用于生产柠檬酸
• 1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在 EMP途径的所有酶；
④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：
柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠 檬酸积累。 ⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌 头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸 的积累及排出细胞外。
小组分工
• • • • 资料查找：杨亚蓝 纪星浩 PPT制作：白云仙 廖文翡 纠错及校对：邵文博 吕佩 PPT讲解：吴雪琴