徐莹生物工艺学-第章菌种选育

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二、对工业化菌种的要求
1.生产能力：能在廉价的培养基上迅速生长，目的代谢
产物的产量高，其它代谢产物少
2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病原菌，不产有害生物活性物质或毒素
一、工业生产常用的微生物
1. 细菌（bacteria）
枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等， 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等
大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸
对谷氨酸定量分析
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乳酸杆菌
应用：乳酸、干酪、奶 子酒、发面、泡菜、 酸奶等的制作
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用固体培养基分离纯培养
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征
（形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。
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同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
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• 选种 • 育种 • 复壮 • 工艺条件和设备
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第一节 菌种来源
来源简介： 土壤、水和空气，尤以土壤中最多。 1、直接分离获得；野生菌株诱变，得到突变株。 2、工业菌种总趋势：从野生菌转向变异菌，自然选
育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组 的定向育种 。 3、藻类、病毒等也正在逐步为工业生产所用。
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三、 自然界工业菌种分离的原则
目的：挑选出性能良好、符合生产需要的纯种 ；
某种特定需要
要获得所需生物特性的新产物，关键是： 1) 微生物——生物产物的来源； 2）合适的筛选方案（检测系统）
自然界菌种分离和筛选的主要步骤
采样 增殖培养 纯种分离
筛选 性能测定
青霉菌
典型的微生物采样和筛选方法
a. 采样地点 b. 采土的深度：一般离表层5～15cm c. 土壤的植被情况：如豆科植物下的土，根瘤菌较多；果树下
的土，酵母菌较多。
d. 采土的最适季节。一般应避免雨季采土，而以秋季采 土比较理想。
e. 土壤的酸碱度。 细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多； 酵母菌和霉菌，一般在偏酸性的土壤、普通植物花 朵、瓜果种子及腐植物等上面较多。
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B 液体培养基分离
有些微小生物必须用液体培养基分离纯培养，
如原生动物、藻类。
方法——稀释法：
接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配
不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（>95％）没有，
那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。
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调查研究并充分阅读资料
设计试验方案 采样
增殖培养
纯种分离
确定采样的生态环境 确定特定的增殖条件
确定定性或半定量的快速检测方法
原种斜面 确定发酵的基本条件
生产性能试验 毒性试验 菌种鉴定
筛选
粗筛(快速检测/1菌株1摇瓶) 复筛（1菌株3-5摇瓶）
结合初筛的工艺条件
较优菌株斜面(3-5株) 再复筛
性能鉴定•ຫໍສະໝຸດ • 枯草芽孢杆菌• 应用：生产淀粉酶
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2、酵母菌（yeast）
单细胞真核生物，常用啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等， 用于：酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和
饲料用酵母菌体蛋白等
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2）抑制不需要的菌类；
•土壤中分离芽孢杆菌时，将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h； •筛选霉菌时，加入四环素等抗生素抑制细菌， •分离放线菌时，加入加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G- 菌）各 30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌
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红霉素、金霉素、庆大霉素 等
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5、担子菌（basidiomycetes） 食用菌（蘑菇、木耳等），用于多糖、橡胶 物质和抗癌药物的开发
6、藻类（algae）
用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、小球 藻、栅列藻； 可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能
显微操作仪，专业程度高
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D 组织分离法
• 适用于分离高等真菌和某些植物病原菌。
在具体应用中，采用哪种方法，应视实际 情况而定。
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2. 控制培养条件，提高筛选工作效率 1） 控制营养成分
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④尽快分离
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（二）目的微生物增殖
增殖培养，也称富集培养，是指实现目的微 生物在种群中数量上占优势的一种技术。
方案： ① 随机 ② 定向培养
①随机： 不能提供任何有助于筛选产生菌的信 息，只能通过随机的办法
②定向培养:给混合菌群提供一些有利于所 需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。 例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。
定向培养的方法：
1）控制一定的养分，需根据微生物的不同种类
选用相应的富集培养基；
•唯一碳源：如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应 底物为唯一碳源 •淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可 溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。 •如要分离耐高渗酵母菌：首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去 取样。富集培养基为5%～6%的麦芽汁，30%～40%葡萄糖， pH3～4，在20～25℃温度下进行培养。
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3）控制培养条件。从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择。
如温度、pH、光照、氧气、营养等。 •当样品中的细胞数较少时(如水)，通常采用膜过滤法。 •如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌 要求偏酸（4.5～6）。
•分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20min。
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青霉菌
应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶 等
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4、放线菌（actinomycetes）
常用菌种来自：链霉菌 属、小单孢菌属和诺卡 氏菌属等 生产：抗生素，如链霉素、
•提问： • 欲获得分解弹性蛋白的菌株去哪里找？
• 能降解有机磷农药的菌种去哪里找？
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③ 规范取样 – 采样的方法：用无菌器具按照规范取样几十克，
装入无菌的塑料袋或纸袋中，扎好。
– 写好标签：记录采样时间、地点、环境情况等， 以备考证。
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物理方法：生物工艺学 表2-2 （P31）
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4）连续富集培养
– 根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑 性的特点，可通过连续富集培养的方法分离 降解高浓度污染物的环保菌。
• 如果按通常分离方法，在培养基平板上 能出现足够数量的目的微生物，则不必 进行富集培养。
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C 单细胞（孢子）分离
从混合培养物中分离出单细胞或者单一微生物的技 术叫做单细胞分离，是当平板和稀分离都不奏效的 情况下使用的一种替代方法。
器具操作的单细胞分离——显微操纵单细胞分离技术
稀释法缺点：只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类
显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养
• 举例： • 使用固体培养基分离某些酶产生菌，其
选择培养基中常含有该酶的作用底物。
2）控制培养基酸碱度
–细菌和放线菌 中性或偏碱性 （pH 7.0或稍高）
–酵母和霉菌 偏酸性 （pH 4-6）
3） 热处理 根据芽孢对热的耐性而淘汰
不产芽孢的细菌和其他微生物。 • 如：要筛选芽孢杆菌，将样品稀
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培养分离中要解决的问题
1、“分离什么和从哪里分离出?”
2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提 纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及 遗传操作的难易程度等。
3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。
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②结合产品的特点
采样时要注意的问题
• 如：耐高渗透压→蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮
积的土壤
• 纤维素酶产生菌 →枯枝、落叶和朽木等作为样品。
• 以石油为基质的微生物时，在含油土壤中，含有能 利用石蜡和芳香烃的微生物比一般土壤多；
• 嗜碱、嗜酸微生物；
• 耐低温、耐高温微生物。。。
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选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗
污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定
4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
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第一篇 生物反应过程原理篇
第二章 菌种选育
徐莹
本章学时分配：8学时 本章授课内容：
第一节 菌种来源
微生物优良生产菌种的特征
第二节 菌种选育
– 自然突变选育 – 诱变选育 – 微生物细胞水平基因重组育种 – 重组DNA技术——分子育种
第三节 衰退、复壮和菌种保藏
• 良好的菌种是微生物应用的基础。 • 以发酵工业为例 • 生产时，围绕菌种，需要开展的工作：
释液经过80℃，10min水浴处理。
•营养体：60-70℃ 10min 杀死； •芽孢：耐100℃以上高温。
芽孢
4）添加抑制剂
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几种菌落
• 曲霉属
应用：生产有机酸、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶 等
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• 黄曲霉 • 应用：酱油、酱类（淀粉酶） 等
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米曲霉
• 应用：产糖化酶和蛋白酶、
主要用于酿酒制曲和酱油制曲
2019/10/17 菌种保藏及作为中国进海洋一大步学 食育品学种院的出发菌株
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问题：
如何使样品中所含目标微生物的可能性大？ 如何在后续的操作中使这种可能性实现？
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（一）采样 1）从大自然中的原材料采样原则： 根据筛选的目的，微生物的分布概况 及菌种的主要特征与外界环境关系等，进 行综合地、具体地分析来决定。
从自然界筛选
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2）采样时要注意的问题（以从土壤取样为例） 气候、水分等环境特点 结合产品的特点 规范取样
尽快分离
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接下来详细讲
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采样时要注意的问题
①气候、水分等环境特点
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（三）分离
增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，要 控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离。
A 用固体培养基
平板划线分离法、 稀释倾注分离法、 涂布分离法、 稀释摇管法
厌氧微生物 可用此法
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在一般情况下，按照各大类微生物常用的培养 基进行分离。
• 细菌——蛋白胨牛肉膏琼脂培养基 • 放线菌——淀粉琼脂培养基 • 酵母、霉菌——麦芽汁或米曲汁培养基。
特殊：
• 分离分解纤维素的微生物，纤维素做为唯一碳源。 • 淀粉做为唯一碳源，具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。
• 针对产生诱导酶类的微生物，必须要有某种分解底物存在。
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红酵母
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啤酒 酵母 9
面包酵母
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3、霉菌（mould）
根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等， 用于：生产多种酶制剂、抗生素
有机酸、甾体激素等
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