天津野生黄伞菌株的酯酶同工酶分析

天津野生黄伞菌株的酯酶同工酶分析
訾惠君;刘连强;周永斌;张志军;魏雪生
【摘要】[Objective]The aim of the study was to classify and identify the Tianjin wild Pholiota adipose strains preliminarily. [ Method]The esterase isoenzyme technology and cluster analysis were used to study 12 strains, including 4 wild strains of Tianjin, 7 commercial Pholiota adipose strains and 1 Pholiota nameko (Ito) et Imai. [ Result]There existed great diversity among Pholiota adiposa strains, and all the strains had common characteristic zymogram bands. Twenty-two bands were observed and there were 11 zymogram types in all tested strains. Pholiota adiposa strains were clusted into 3 groups. Four Tianjin wild strains were clused in one group, suggesting they had closer genetic relationship than the strains from other areas. [ Conclusion ] The study provided preference for germplasm identification, resource protection and breeding of Pholiota adipose.%[目的]对天津野生黄伞菌株进行初步分类鉴定.[方法]利用酯酶同工酶技术对4个野生菌株、7个引入黄伞菌株及1个滑菇菌株进行聚类分析.[结果]12个菌株共检出22条酶带,11种酶谱类型.黄伞菌株具有共同特征谱带,且遗传多样性丰富.菌株分为3大类群,天津野生黄伞聚为一个类群,亲缘关系相近,而与其他菌株的亲缘关系相对较远.[结论]为黄伞种质鉴定、资源保护和育种提供参考.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)023
【总页数】2页(P13940-13941)
【关键词】天津野生黄伞;酯酶同工酶;聚类分析;遗传多样性
【作者】訾惠君;刘连强;周永斌;张志军;魏雪生
【作者单位】天津市林业果树研究所,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384;天津市林业果树研究所,天津300384
【正文语种】中文
【中图分类】S646
黄伞［Pholiota adiposa(Fr.)Quél.］，又名多脂鳞伞或肥鳞伞［1］，隶属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科、鳞伞属。

其子实体菌肉肥厚、营养丰富，菌盖表面有一层粘液，是一种核酸物质，具有恢复人体精力和脑力的特殊作用，从中提取的多糖具有强烈抗癌活性，是一种药膳同功的珍稀食用菌［2－3］。

野生黄伞在我国分布广泛，尤以北方地区常见。

每年5～6月和8～10月生长于杨、柳及桦等倒木或枯枝上［4］。

目前国内对黄伞的研究主要集中在野生驯化、生物学特性及人工栽培技术等方面，对黄伞野生资源分类鉴定研究尚未见报道。

笔者利用酯酶同工酶技术对采集的天津野生黄伞与已驯化栽培的菌株进行分析，为种质鉴定、资源保护和育种提供参考。

1 材料与方法
1.1 菌株Pa-1、2、3、4为采集天津野生黄伞组织分离获得菌株;Pa-5、6、7购于福建三明市真菌研究所;Pa-8购于江苏江都天达公司;Pa-9购于湖北华中农业大学;Pa-10为来源于河南的滑菇;Pa-11购于北京吉蕈公司;Pa-12来源于湖南。

1.2 培养基及试剂PDA固体培养基;PDM液体培养基;分离胶缓冲液(pH 8.9);浓缩
胶缓冲液(pH 6.7);10%过硫酸氨(AP);分离胶母液;浓缩胶母液;电极缓冲液Tris-Gly(pH 8.3);0.1%溴酚蓝水溶液;pH 7.4磷酸缓冲液;酯酶染色液［5］。

1.3 方法
1.3.1 菌丝活化。

将供试菌种分别接种于无菌PDA斜面培养基上，25℃恒温培养14 d。

1.3.2 菌丝体液体培养。

将活化后的供试菌株分别接种于含有100 ml无菌PDM 液体培养基的250 ml三角瓶内，25℃、150 r/min摇床培养15 d。

1.3.3 酶液制备。

将培养所得菌丝球用尼龙网过滤，无菌水冲洗2～3次，滤纸吸干水分，－20℃低温冰箱冷冻24 h后，置于灭菌研钵中，再加入与菌丝等重量pH 7.4的样品提取液，冰浴上充分研磨成糊状。

在4℃、10 000 r/min下离心10 min，取上清。

将上清液、40%蔗糖溶液、0.1%溴酚蓝溶液按5∶1∶1混匀即为电泳样品，于4℃冰箱内保存备用。

1.3.4 制胶与点样。

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度7%(pH 8.9);浓缩胶浓度4%(pH 6.7);电极缓冲液为Tris-Gly系统(pH 8.3);点样量50 μl。

1.3.5 电泳及染色。

开始电泳采用15 mA的电流，待溴酚蓝进入分离胶后，将电泳槽放入冰浴中进行低温电泳，加大电流至30 mA，当溴酚蓝距胶板底部1 cm 时，停止电泳。

电泳结束后，将凝胶转入染色液中，37℃下染色30 min，待显出清晰酶带后，用蒸馏水漂洗数次，7%醋酸固定脱色后拍照［5］。

1.4 数据处理测量酶谱带迁移距离，计算迁移率(Rf，Rf=酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离)并绘制酶谱图。

将凝胶上的染色酶带分为:0=没有;1=有。

统计各个菌株的酯酶同工酶信息，输入聚类分析软件NTsys
2.10e进行分析，建立各菌株酯酶同工酶的聚类树状图。

2 结果与分析
2.1 供试菌株酯酶同工酶表型分析
2.1.1 12个菌株酯酶条带的差异。

根据酶带Rf值绘制的酯酶同工酶电泳酶谱简化图见图1。

由图1可知，12个菌株共检测出迁移率不同的22条谱带，Rf值为
0.10～0.81，绝大多数菌株间酶谱带数目和迁移率不同，各菌株的酶带数目为7～12条。

供试12个菌株分为11个酶谱类型，绝大部分菌株酶带存在遗传差异。

Est5(Rf=0.29)、Est16(Rf=0.64)、Est21(Rf=0.78)在供试的12个菌株中均表现。

菌株Pa-10为滑菇，在分类上与黄伞同属鳞伞属，因此Est5、Est16、Est21可作为鳞伞属菌株的基础酶谱带。

滑菇(Pa-10)除3条基础谱带外，酶谱类型与其他11个菌株差异较大。

2.1.2 黄伞菌株酶谱特征。

酶带Est18(Rf=0.69)在供试11个黄伞菌株中均表现，Est12(Rf=0.54)在除Pa-3的10个黄伞菌株中表现，而滑菇(Pa-10)酶谱中未出现，Est12、Est18可作为黄伞菌株特有的基础酶带。

Pa-6、Pa-7的酶谱带完全相同。

2.1.3 天津野生黄伞酶谱特征。

野生黄伞酶谱除基础酶带外，Est6(Rf=0.34)只在4个天津野生菌株中表现，其他菌株未出现。

图1 12个菌株酯酶同工酶图谱Fig.1 Esterase isoenzyme electrophoresis of
12 strains
2.2 基于酯酶同工酶聚类分析由图2可知，12个菌株两两间相似系数(GS)为
0.54～1.00。

在相似系数0.54水平上，可将12个菌株划分为2大类群，第Ⅰ大
类群包括11个黄伞菌株;滑菇菌株为第Ⅱ大类群。

第Ⅰ大类群中，在0.76水平上可划分为3个类群:4个天津野生黄伞菌株被聚为一个类群;第2类群为购于福建的菌株;第3类群包括从江苏、湖北、北京、湖南等地引入的菌株。

在天津地区采集的野生菌株相似系数在0.80～0.91，与其他菌株的
遗传距离稍远(GS＜0.754)。

2.3 亲缘关系分析Pa-10(滑菇)与黄伞同属不同种，因此与11个黄伞菌株亲缘关
系较远。

4个野生株之间的相似系数较从其他省市引入的黄伞菌株高，反映了聚类
关系可能与地理来源相关。

Pa-6与Pa-7相似系数为1.00，表明在遗传上没有变化，估计为同种异名。

3 讨论
同工酶分析技术，可以从蛋白质水平反映物种的遗传变异，具有分辨率高，操作简便、快捷、成本低廉等特点［6］，目前已广泛应用于食用菌菌株的鉴别中［7］。

其中，酯酶同工酶是最稳定、易检测的酶系统，成为食用菌鉴定常采用的方法之一［8］。

图2 12个菌株酯酶同工酶树状聚类图Fig.2 Dendrogram of esterase isoenzyme of 12 strains
该试验结果显示，黄伞菌株之间菌丝体酯酶同工酶的差异显著，表明我国黄伞种质资源非常丰富，且其亲缘关系可能与地理分布区域具有一定相关性。

如天津地区野外采集的4个菌株共有一条特征性的酶带聚为一类，而与地理位置较远的菌株遗
传相似性较低。

4个野生菌株间的相似系数为0.80～0.91，表明天津地区的野生
黄伞遗传多样性较丰富。

黄伞除共同的特征谱带，大部分菌株酶谱存在差异，说明酯酶同工酶能够准确地反映种或菌株水平上的遗传差异，可作为有效生化标记，为黄伞菌种群的分类、鉴定、育种提供科学依据。

参考文献
［1］刘波.山西大型食用真菌［M］.太原:山西高校联合出版社，1991:59－60. ［2］应建浙，赵继鼎，卯晓岚，等.食用蘑菇［M］.北京:科学出版社，1984:1－255.
［3］黄清荣，辛晓林，姜华，等.碳、氮浓度对黄伞深层培养的影响［J］.河南农
业科学，2006(2):90－92.
［4］马凤，张天民，昌明，等.黑龙江省珍稀野生黄伞驯化栽培技术的研究［J］.
中国林副特产，2006(5):34－37.
［5］中华人民共和国农业部.食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法(NY/T 1097－20006)［S］.北京:中国标准出版社，2006.
［6］张树庭，林芳灿.蕈菌遗传与育种［M］.北京:中国农业出版社，1997:90. ［7］李中振，田廷亮，丁书茂，等.灵芝超氧化物歧化酶同工酶的研究［J］.中国食用菌，1997(4):32－34.
［8］王贤樵，王泽生.双孢蘑菇同工酶标记筛选研究［J］.中国食用菌，1989(6):7－11.。