磷酸钙法细胞转染试剂盒
腺病毒操作资料说明
腺病毒操作资料说明
1、AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
2、AD-293 Cells.pdf：腺病毒包装细胞说明书，作为操作指南；
3、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
4、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
5、Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
6、腺病毒扩增和纯化手册.pdf：腺病毒扩增和纯化方法，作为理论学习
7、腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染.doc：腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染操作指南；
8、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；。
磷酸钙法细胞转染试剂盒
磷酸钙法细胞转染试剂盒简介：外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。
Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞转染：1、 在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。
后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2、 在加入DNA 之前2～4h ，加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。
3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
4、 取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
5、 室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
6、 取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。
7、 置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。
8、 去除培养液，用PBS 清洗细胞2次，加入2ml 完全培养液继续培养，一般24h 后可见转染细胞的表达。
(二)悬浮细胞转染：1、 低速离心收集悬浮细胞，用PBS 洗涤1次。
2、 取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
编号 名称CZ0008 100T CZ0008200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃使用说明书 1份3、取BBS solution，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2溶液。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
碧云天C0528 Lipo6000TM转染试剂
Lipo6000TM转染试剂产品简介：Lipo6000TM转染试剂(Lipo6000TM Transfection Reagent)是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。
适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。
Lipo6000TM转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。
Lipo6000TM转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine®2000Reagent完全一致。
并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和Lipofectamine® 2000 Reagent相当甚至略高。
Lipo6000TM转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。
Lipo6000TM转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。
Lipo6000TM转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。
但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。
Lipo6000TM转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。
Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效果比较请参考图1-6。
图1. Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效率的比较。
C0508 磷酸钙法细胞转染试剂盒说明书
磷酸钙法细胞转染试剂盒
产品名称 磷酸钙法细胞转染试剂盒
包装 >200次
产品简介：
¾ 碧云天生产的磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)，在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上 进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
¾ HEK293或HEK293T细胞，即通常所谓的293细胞，是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达 90%以上；通常很容易达到40-50%左右的转染效率。大多数常见的细胞例如Hela细胞、CHO细胞等也都适合磷酸钙法转 染，但效率比293细胞要略低一些。
¾ 本试剂盒不仅适合于大多数贴壁细胞的转染，也适用于一些悬浮细胞的转染。 ¾ 本试剂盒提供的试剂都经无菌处理，可以直接使用。 ¾ 关于不同的细胞转染试剂的主要特点和差异方面的比较，以及如何选择适当的细胞转染试剂，可参考碧云天的相关网
2. 对于悬浮细胞： a) 离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤一次。 b) 按照上面的步骤c)和d)制备DNA-氯化钙-BBS混合物。 c) 每106个细胞的沉淀，用100微升DNA-氯化钙-BBS混合物重新悬浮，室温放置20分钟。 d) 在一个6孔板孔内加入2毫升完全培养液，然后加入来自上一步的细胞-DNA-氯化钙-BBS混合物，混匀。
e) 在含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。 f) 根据实验要求和磷酸钙对于不同细胞的毒性不同，在4-16小时后离心收集细胞，用PBS洗一次，然后用2毫升完全培
养液重新悬浮细胞，继续培养。 g) 通常在转染约24小时后就可以检测到转染基因的表达。
使用本产品的文献：
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
RNA干扰步骤
一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖 1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
各种细胞转染方法比较
GIBCO BRL，Promega
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染，瞬时转染
转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（>65kb）但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少1-20
Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）
CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）
Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）
阳离子聚合物
带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
瞬时转染，特定宿主细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
中国科学院典型培养物保藏委员会
Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达
瞬时性转染，稳定转染
可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
磷酸钙转染法
通过DNA，氯化钙与磷酸缓冲液混合， 沉淀形成包含DNA且极小不溶的磷酸钙颗 DNA 粒。这些磷酸钙－DNA复合物黏附到细胞 ic kidney (HEK) 293T GFP-Axin ( 3µg ) 2M CaCl2 2×HBS （pH 7.05）
方法
转染前24h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基 DMEM以5×104至2×105细胞/cm2的密度平铺细胞于35mm 组织培养皿上,于含5％～7％CO2的37℃温箱孵育20～24h。 转染前1h换液。 注：为得到较高的转染效率，注意使用指数生长的细胞， 转染时细胞的密度不超过80％。这点很重要。 制备磷酸钙－DNA沉淀：将5µl的DNA与104.5µl的灭菌水混匀， 再加入15.5µl的2M CaCl2，吹吸混匀。将以上钙－DNA溶液与等体 积（125µl ）的2×HBS盐溶液混合, 逐滴加入。迅速弹敲管侧壁混 匀溶液，立即将磷酸钙－DNA悬液逐滴加入至上述单层细胞的细 胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀培养基。 注：培养基会变成浑浊的橘黄色。一旦形成大颗粒沉淀，转染效率 会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]
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聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]生物通技术专评：数百万年来原核生物如大肠杆菌就经常相互分享它们的遗传物质的——受到自然的启发，出现了将DNA导入哺乳动物培养细胞的技术——这是分子生物学的又一个重要的里程碑。
也多谢这种技术的不断进步，我们终于可以在各种哺乳动物细胞中进行各种克隆化基因的表达，从而达到不同的目的－－比如，生产制备大量经过真核特有的翻译后加工的活性蛋白；研究表达蛋白的结构和生化特性；研究基因表达的调控机理；甚至调控基因的表达等等。
可以说在哺乳动物细胞中表达外源基因的2个关键：一个是选择构建合适的表达载体和表达细胞株，另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细胞中进行表达。
转染技术的广泛使用促进了人们对外源基因在哺乳动物细胞中的表达等方面的认识，并在方法学上促进了该领域及相关领域的发展。
从磷酸钙到脂质体，到多胺，可用于转染的细胞种类已越来越多，转染试剂也不断更新换代，而转染也不再仅限于将DNA转入细胞中了，RNA，siRNA，蛋白质等等生物大分子也进入了转染的行列。
在纷纭的产品中，你会选择哪种转染试剂？生物通这个转染试剂专辑希望为大家介绍市面上主流的转染试剂和各自的个性特点和适用范围－－可以说，针对不同的细胞株，不同的转染实验目的，还有不同的转染要求，很难找到一种能满足所有的要求，十全十美的产品。
你需要一一尝试和优化条件——但是了解市面上各种产品的特点与长短，无论是对于转染新手，或者是“老革命遇到新问题”，都是有益的。
在生物通这个转染试剂专辑系列我们将分别介绍国外几个经典好用的王牌产品，以及国内物美价廉的后起之秀，以及总结一些使用心得和注意事项。
如果你有自己的心得并愿意和大家分享，欢迎投稿生物通哦:)一、打开转染之门：基本概念作为篇首还是要把老调调再弹弹。
请原谅我有点“唐僧”的回顾几种经典转染方法。
DEAE-葡聚糖（Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran）：这个早在1965年出现的转染方法差不多是最古董级的方法之一了，直到现在竟然还有少数人坚持采用。
细胞培养与细胞转染
细胞培养与细胞转染目的学习细胞培养的基本方法掌握磷酸钙法转染细胞的原理及操作步骤体外细胞培养技术细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。
细胞分类：贴壁细胞和悬浮细胞优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。
原代培养（primary culture）：直接取材于有机体组织的细胞进行培养传代培养（secondary culture）：把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养细胞体外培养所需的一般条件：适宜的培养皿血清成分37℃ 5％CO295～100％湿度抗生素细胞系（cell line）：在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代。
常见的细胞系：NIH3T3细胞系：1963年取自小鼠胚胎细胞建立Hela细胞系：1952年取自人宫颈癌细胞建立细胞培养基本技术培养用品的清洗和消毒无菌操作培养用液的配制组织取材和分离细胞传代培养培养用品的清洗和消毒1.清洗：浸泡，刷洗，清洁液浸泡，冲洗2 包装3 培养用品的消毒灭菌干热消毒湿热消毒紫外线消毒过滤除菌消毒消毒剂和抗生素一次性用品无菌操作（一）清点培养物品和用具（二）操作野消毒，紫外线灯 30分（三）洗手和着装（四）培养过程中的操作酒精灯的使用，物品的摆放（五）操作后台面的清洁和复位培养用液水和平衡盐溶液天然培养基合成培养基水和平衡盐溶液超纯水和三蒸水，双蒸水只能用于清洗平衡盐溶液：配制培养液，洗涤组织和细胞Hanks, D-Hanks, PBS,HEPES等天然培养基血清，水解乳蛋白和胶原血清：小牛血清，胎牛血清，马血清，兔血清，人血清热灭活处理：56度，30分，灭活补体合成培养基DMEM: MEM基础上改良而成，用于生长快，附着性差的肿瘤细胞RPMI1640：应用广泛，用于正常细胞和肿瘤细胞HAM F12：单细胞的培养TC199：较少应用无血清培养基大多数细胞的培养依赖天然培养基，如血清，但干扰实验稳定HAM F12＋ DMEM（1：1）混合，再加入其它成分其他常用液体消化液：消化分散细胞胰酶：0.25％ ,0.125%EDTA: 0.02％（乙二胺四乙酸二钠）抗生素液：抗污染青霉素，链霉素，卡那霉素，庆大霉素联合使用效果更好细胞传代培养贴壁细胞采用消化法，悬浮细胞可直接吹打，离心后传代材料细胞g/ml链霉素，0.03%谷氨酰胺）μ DMEM培养液（Gibcol公司，含10%小牛血清，100U/ml 青霉素，100胰酶 (0.25%)PBS （pH7.4）细胞培养皿（培养板）CO2培养箱超净台步骤倒出旧培养液，Hanks液洗2-3次加少许消化液，37度消化1-2分钟镜下观察到细胞呈球形，胞质回缩，细胞间隙增大时，弃消化液，加3-5ml培养液终止消化吹下细胞，混匀，分装2-3个培养瓶细胞转染转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。
一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价
一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【摘要】目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293 T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293 T细胞的方法.方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率.采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)mRNA和flag蛋白表达水平.结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后的转染效率明显升高(P<0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后,TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平均明显升高(P<0.01).结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】6页(P1177-1181,前插5)【关键词】磷酸钙转染;293T细胞;肿瘤坏死因子受体相关因子6;flag蛋白【作者】华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【作者单位】福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005【正文语种】中文【中图分类】Q819目前，将质粒DNA导入动物细胞的方法有很多，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微注射法和磷酸钙共沉淀法等[1]。
8、细胞转染(脂质体介导法)
三、实验材料与器材
1材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素(双抗)
FCS(小牛血清)
PBS(磷酸盐缓冲溶液)
胰酶/EDTA消化液
转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/ 200ul/1ml微量移液器和Tip头
利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔
性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效
率却较高。
Gen Escort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的
交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的
一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白) ，为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击
法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体
物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了
外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
磷酸钙转染
3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
5 Invitrogen Corporation 阳离子脂质体转染指南,2003,(1)
6 颜子颖等译 精编分子生物学实验指南 北京:科学技术出版社,1998,274-328
7 晶美实验新知 晶美生物工程有限公司
8 李华等 基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较,中国实验动物学杂志,2000,10,(2):65-68
3 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection Kit Cat. no. K2780-01
4 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection System Cat. no. 18306-019
xiaoxiangyuyu：我用磷酸钙方法将质粒转染L02、HepG2、3T3、COS 细胞，用免疫组化方法鉴定转染结果，只有第一次作出的为阳性结果，后面均为阴性，想请教大家如何提高磷酸钙法的转染效率，转染歨鄹要注意些什么
丁香园网友gordon83认为：
我觉得做钙转有几点要注意：一是细胞的生长状态，好的培养状态对提高转染效率有很多的左右，我做293T时一般是用接种15~20小时细胞，这时细胞密度为70%左右；二是可以用氯喹处理细胞，这样能提高转染效率，三磷酸钙的颗粒，尽量做的最小，我一般是先把DNA 水和氯化钙先加EP管混匀后，将EP管放在Vortex上将转速调到500rpm，然后逐滴加入HBS.加完后迅速均匀加入到dish中，过7~11小时换液.
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
sirna转染常见问题解答
siRNA转染常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
8、细胞转染(脂质体介导法)
细胞转染（脂质体介导法）细胞转染可以：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）应用于转基因动植物；（3）应用于生物制药、基因治疗、RNA干扰。
实验材料：293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒试剂、试剂盒：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、转染试剂、链霉素、小牛血清仪器、耗材：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜、CCD其他：研究进展1. 转染技术国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效转染试剂率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。
目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。
2. 转染效率线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。
但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。
超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。
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磷酸钙法细胞转染试剂盒
简介：
外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。
Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
HEK293是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达85%以上，一般的转染效率可达40～50%左右。
其他常见细胞(例如Hela 、CHO 细胞等)也适合磷酸钙法转染，但效率比293细胞要略低一些。
本转染试剂盒主要适合于大多数贴壁细胞的转染，也可于一些悬浮细胞的转染，一般要求DNA 浓度在10～50μg 为宜，Hela 、BALB 等细胞沉淀放置16h ，CHO 、DUKX 、B Ⅱ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。
组成：
自备材料：
1、 胰蛋白酶消化液
2、 完全培养基
3、 PBS
4、 无菌水
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁细胞转染：
1、 在转染前用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达即可进行转染。
后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2、 在加入DNA 之，加入不含抗生素的完全培养液，置于CO 2培养箱培养。
3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。
编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃
使用说明书 1份
4、取BBS solution 100μl，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2
溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
5、室温静置，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
6、取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。
7、置于CO2培养箱培养。
如果培养细胞为CHO、DUKX等，可以DMSO或甘油进行休
克处理，转染效率会大大增加，即培养后，用含10%甘油或20%DMSO的完全培养液替换当前培养液，室温下静置，加PBS摇动混匀。
8、去除培养液，用PBS清洗细胞2次，加入完全培养液继续培养，一般24h后可见转染
细胞的表达。
(二)悬浮细胞转染：
1、低速离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤1次。
2、取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution，混匀，即为DNA-CaCl2
溶液。
3、取BBS solution 100μl，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2
溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
4、室温静置，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
5、每106个细胞沉淀用DNA-CaCl2-BBS溶液重新悬浮，室温放置。
6、6孔板每孔加入不含抗生素的完全培养基，取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入
到6孔板中，轻轻晃动混匀。
7、置于37℃5% CO2培养箱培养，去除培养液，用PBS清洗细胞，加入完全培养液继续
培养，一般24h后可见转染细胞的表达。
注意事项：
1、注意无菌操作，尽量避免污染，同时DNA不应含有蛋白和酚。
2、休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。
3、转染12～24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。
4、BBS solution的pH值直接关系到转染效率，尽量避免长时间暴露在空气中，以免被空气中的二氧化碳酸化。
有效期：6个月有效。