磷酸钙转染法
转化和转染的概念和区别
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。
载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
磷酸钙转染方法的优化
磷酸钙转染方法的优化程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【摘要】通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及 CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响，确定最佳的转染条件。
以各单因素试验的最适条件为依据，设计三因素三水平的正交试验。
结果表明，磷酸钙介导质粒DNA转染，当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒 DNA 的量为30μg、细胞培养环境 CO2浓度为3%时，转染效果最佳。
%In this study,the effects of seeding density of 293T cells,as well as the amount of plasmid DNA and the concentration of CO2 in culture environment,on the efficiency of calcium phosphate transfec—tion were compared,optimum transfection condition was confirmed.On the basis of optimum condition obtained from single factor experiments,orthogonal tests in three levels of three factors were designed and performed.The results showed that the highest transfection efficiency was obtained when the seeding den—sity of 293T cells was 5×105/mL,the amount of plasmid DNA was 30μg and the concentration of CO2 in culture environment was 3%.【期刊名称】《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P776-780)【关键词】磷酸钙;质粒DNA转染;293T细胞;接种密度【作者】程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【作者单位】内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010【正文语种】中文【中图分类】Q987.2近年来关于诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究[1-4]是生物技术研究领域的热点之一,在iPSCs的研究中,应用最多的载体是逆转录病毒载体和慢病毒载体,二者都能获得很高的诱导效率.将逆转录病毒载体和包装质粒一起转染到293T细胞后培养一段时间即可制备逆转录病毒颗粒.采用质粒DNA 转染293T细胞的方法有多种,应用较为广泛的有脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法等.用以转染的脂质体多为商业化的脂质体,性质稳定,转染效率高,但价格昂贵.电穿孔法操作简单,但是需要对相应实验条件进行摸索,同时细胞在转染时的致死率大.磷酸钙应用成本低,对具体的体系加以优化后也能获得比较高的转染效率和病毒滴度.本实验采用磷酸钙转染的方法,从293T细胞的接种密度、质粒DNA的量及CO2浓度三方面进行研究,确定最佳的转染条件,以便为后续诱导人的iPS细胞进行准备.1.1 试剂和溶液试剂:胰蛋白酶、台盼蓝购于Amresco公司,EDTA,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于杭州四季青公司,DMEM(高糖)培养基购于Gibco公司,青霉素、链霉素购于华北制药,其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司,重组逆转录病毒载体p EYK-E4由内蒙古科技大学王建英教授惠赠,其病毒包装载体p LP1、p LP2、p LP/VSVG购于Invitrogen公司.溶液:D-Hanks液、胰蛋白酶消化液(0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA)、0.4%台盼蓝染液、含10%FBS的DMEM(高糖)培养液(青霉素100IU/m L、链霉素100μg/m L)、含不同浓度FBS的各种培养液、细胞冷冻液.除非特别说明,文中所用相应溶液的配制方法均参见文献[5].1.2 磷酸钙介导质粒DNA转染和包装病毒的生产、收集转染前24 h,通过胰酶消化收集对数期生长的293T细胞,以适宜的密度接种于100 mm培养皿.加入10 m L完全培养液,于5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱过夜培养细胞.取适量超螺旋质粒DNA溶于0.5 m L 0.25 mol/L CaCl2,混匀,然后将其加至0.5 m L 2×BES缓冲液中,室温下孵育10～20 min.重组逆转录病毒载体质粒和包装质粒的比为p EYK-E4∶p LP1∶p LP2∶p LP/VSVG=1∶0.45∶0.45∶0.8.滴加CaCl2-DNA-BBS溶液于细胞中,轻轻旋转以混匀.放入适宜CO2浓度、饱和湿度、37℃的培养箱中培养细胞12～16 h.吸去培养液,用培养液洗涤细胞2次.加10 m L新鲜的完全培养液.于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养32～36 h.转染48 h后细胞培养液中已含有病毒,可以收集含病毒的培养液.1.3 转染条件的优化1.3.1 磷酸钙介导质粒DNA转染中293T细胞的接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105, 5×105,10×105,50×105个/m L将293T细胞接种于100 mm 培养皿中,每皿加10 m L细胞悬液,转染时质粒DNA量为30 g、CO2浓度为5%.转染后测定滴度,以确定转染时293T细胞的最优接种密度.1.3.2 磷酸钙介导质粒DNA转染中质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用1.3.1中所得的最佳接种密度,设置细胞培养环境CO2浓度为5%,质粒DNA的量为10,20,30,40,50μg,转染后测定滴度,以确定转染时质粒DNA的最佳用量.1.3.3 磷酸钙介导质粒DNA转染中细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响采用上两步骤中所得的最佳接种密度和最佳质粒DNA的量.转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%、5%5个梯度.转染后测定滴度,确定转染时最优的细胞培养环境CO2浓度.1.3.4 磷酸钙介导的质粒DNA转染条件中影响病毒包装效率因素的正交实验根据最优条件设计三因素三水平的正交实验,以确定三因素中的主次关系及病毒包装的最优化转染条件.1.4 逆转录病毒颗粒滴度的测定将收集的含病毒的培养基,转入15 m L离心管中,4℃4 500 r/min离心5 min沉淀细胞碎片,吸取上清液,以0.45μm滤膜的滤器过滤上清液.取相应体积的液体进行病毒滴度的测定.其他的则以2 m L的量分装在冷冻管里,置于-80℃下保存备用.提前24 h在6孔板中接种293T细胞,每孔接种2×105个,培养过夜汇合度达到20%～50%.取病毒上清液分别加入新鲜的培养液稀释102、103、104、105、106倍,同时加入Polybrene浓缩液,使Polybrene浓度达到6μg/m L.移去孔中的培养基,以D-Hanks溶液冲洗两次后,每孔加入1 m L稀释液,并设置不加病毒上清液的空白对照孔.置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中吸附5 h,移去培养液,加入10%FBS的DMEM (高糖)完全培养液,同时向全部的孔中加入博莱霉素浓缩液,终浓度为200μg/m L.每2～3 d换液一次,同时观察处理孔和对照孔的细胞状态,包括细胞死亡的状况和抗性集落的出现.第13 d对各孔中的集落数目进行计数.取数量适中且细胞集落比较清晰的孔的数据进行计算:病毒滴度(CFU/m L)=细胞集落个数×稀释倍数/加入的病毒液体积.2.1 293T细胞接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105,5×105,10×105, 50×105个/m L接种293T细胞,转染时质粒DNA量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为5%,所获得的病毒的滴度如图1所示.由图1可知,293T细胞的接种密度对病毒包装效率具有一定影响.在接种密度达到5×105个/m L时,所获得的病毒的滴度是最大的,能达到6 500 CFU/m L;接种密度在1×105个/m L、10×105个/m L时,所获得的病毒的滴度分别为6 100 CFU/m L和5 900 CFU/m L,相比之下差异显著(P＞0.05);接种密度为5×104个/m L和50×105个/m L时,病毒的滴度不理想,只能达到4 700 CFU/m L和4 200 CFU/m L.因此在进行磷酸钙介导的质粒DNA转染时,293T细胞的接种密度以5×105个/m L为宜.2.2 质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用5×105个/m L的293T细胞接种密度,设置CO2浓度为5%,转染时质粒DNA的量设置为10, 20,30,40,50μg,转染后测定滴度,所获得的病毒的滴度如图2所示.由图2可知,质粒DNA用量从10μg到20μg,病毒滴度有上升的趋势,在20μg时病毒的滴度最大,为7 300 CFU/m L,而10μg时仅能达到5 900 CFU/m L,虽然质粒DNA量为30μg时病毒的滴度有所下降,但是也能达到6 900 CFU/m L,与前一个梯度差异不显著(P＞0.05).继续加大质粒DNA的量时,病毒的滴度呈现比较大幅度的下降.当质粒DNA量为40μg和50μg时,病毒的滴度分别为5 300 CFU/m L和5200 CFU/m L,二者差异不显著(P＞0.05),说明此时质粒DNA量并不再足以影响病毒的包装效率.因此质粒DNA的量在20μg时比较适宜.2.3 细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响293T细胞的接种密度以5×105个/m L、质粒DNA的量为20μg,转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%及5%,转染后测定的病毒滴度,结果如图3所示.由图3可知,细胞培养环境CO2浓度对对病毒包装效率的影响是比较明显的,从1%到3%呈现快速上升的态势,在细胞培养环境CO2浓度为3%时,病毒的滴度达到了最大值,为1.46×104CFU/m L,随后细胞培养环境CO2浓度逐渐增高,所获得的病毒的滴度也在下降.细胞培养环境CO2浓度为1%时病毒滴度只能达到5 600 CFU/m L,为最低值;细胞培养环境CO2浓度为2%可达到9600 CFU/m L,低于细胞培养环境CO2浓度为4%时的1.20×104CFU/m L,但要比细胞培养环境CO2浓度为5%时的7000 CFU/m L要高.因此比较适宜的范围为2%～4%,本文选择3%为适宜条件.2.4 正交实验根据各单因素试验(293T细胞的接种密度、细胞培养环境CO2浓度、质粒DNA 的量)的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验,见表1,所得结果如表2所示.由表2中的极差分析可知,影响病毒包装效率的磷酸钙介导质粒DNA转染三个因素的主次关系为B＞C＞A,即细胞培养环境CO2浓度＞质粒DNA的量＞293T细胞接种密度,最优水平的组合为A2B2C3,即转染的最佳条件为293T细胞的接种密度5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度3%、质粒DNA的量30μg.使用磷酸钙介导的质粒DNA转染293T细胞制备逆转录病毒颗粒时,最佳的条件为293T细胞的接种密度为5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度为3%、质粒DNA的量为30μg,此条件下可获得1.9×104CFU/ml的病毒滴度.本实验参照的是文献[6]中改进型的磷酸钙介导质粒DNA转染真核细胞的方法,这种方法相对于传统方法的效率要高出很多.本实验以转染中最为关键的影响因素对转染体系做了相应的优化.293T细胞是本次实验中所使用的包装细胞系.这种细胞是最适合磷酸钙法转染的细胞之一,在优化后的转染条件中能达到很高的病毒滴度.而293T细胞接种密度对本实验的影响不仅仅限于转染的进行,还包括病毒生产的过程.Kotani等[7]认为逆转录病毒的滴度和使用的包装细胞数量是相关的,而杨生玺等[8]的研究称逆转录病毒的滴度随包装细胞(PA317)密度上升而上升.但本实验使用的100 mm培养皿的最适的接种密度为5×105个/m L,细胞的接种密度过小或过大都会影响实验结果.低的接种密度在进行转染时,细胞的绝对数量达不到,相应的被转染的细胞数量也就少;由于293T细胞生长很迅速,当接种密度过大时,在进行转染时,细胞的汇合度就会很大,细胞的生长活动会受到抑制,同时293T细胞的贴壁性不强,汇合度大的细胞在转染和病毒制备的过程中会成片的浮起,极大影响病毒的制备.而且293T细胞的生长状态也很重要,进行转染和病毒生产的细胞一般都要是生长旺盛的细胞,而293T细胞汇合度很高时,其细胞的生长状态会受到抑制,长满后的细胞明显衰退,抑制了病毒的生产.有研究[9]使用无CO2和低温的环境来减缓已经长满后的细胞的衰退,从而提高病毒分泌效率.而本实验中,生长状态好的293T细胞接种24 h汇合度能达到50%左右,进行转染、病毒生产后,细胞则基本长满培养皿底部,细胞状态和数量均能达到最佳状态.质粒DNA的量会影响磷酸钙-DNA沉淀的性质.实验中只有质粒DNA量在20μg 和30μg时转染效率和病毒的包装效率比较高.DNA的量在实验中是以质粒DNA 的浓度来体现的,DNA最佳浓度的范围较窄,合适的DNA浓度形成的磷酸钙-DNA 沉淀会更易形成细致的沉淀,利于转染.同时质粒DNA的纯度、形式也会对转染效率有影响.由于细菌污染的抑制作用,不纯的质粒DNA转染的效率极低;线性质粒DNA转化效率的也是很低的,因为其与磷酸钙形成沉淀的速度慢,DNA与胞内核酸酶接触时间比较长[10-11].所以本实验中使用的质粒DNA都是使用高纯度质粒DNA提取试剂盒提取的,其的值都在1.8～1.9,经过电泳检测抽提到的质粒基本上都是超螺旋状态的.CO2浓度对病毒包装效率的影响是通过影响培养液p H环境而实现的.也有研究[9]使用了无CO2培养条件和32℃的低温,称获得的病毒滴度能提高10倍,而这种条件影响的不仅包括p H,还有细胞的生长状态,与普通的磷酸钙转染体系差别很大.一般细胞培养使用的培养液中都会有Na HCO3,通过HCO-3/CO2缓冲系统维持p H于7.2～7.4之间的稳定,而与之相配的CO2气体环境一般在5%才能补偿外溢的CO2,以防止其碱化.但磷酸钙-DNA沉淀形成的缓慢过程中,则需要微酸的p H,最佳的p H为6.96[6].所以2×BES的在配制的时候,p H值严格要求在6.96,然后就要采用适宜的CO2浓度来维持p H的稳定.从实验结果来看,1%CO2浓度则显然过低,其获得的病毒滴度也是最低的.最为常用的5%CO2浓度并不适合于磷酸钙介导的质粒DNA转染,其维持的培养液的p H相对来说还是偏碱性的.最适条件3%CO2浓度中所能获得病毒的滴度是5%CO2浓度环境中的2倍以上,低CO2浓度的培养,能显著的提高病毒的包装效率.本实验确定的最优化的转染条件所获得的病毒滴度是较高的,达到了1.9×104CFU/m L,并不低于其他报道[8,9,12-13]中逆转录病毒载体包装时所得到的病毒滴度.有研究称单个质粒转染的效率要高于多质粒共转染,采取单个质粒分批次转染的方式有时可以获取更高的病毒滴度.本实验采用的多质粒共转染的方式,这主要是因为单质粒分批转染时间长、操作环节多,加之293T细胞生长速度快、细胞贴壁性不好,转染操作也会对其造成损伤,使得后续质粒转染效果会受到影响,也易对细胞培养体系造成污染.【相关文献】[1] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.[2] Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.[3] Yamanaka S.Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation[J].Nature,2009,460(7251):49-52.[4] Trokovic R,Weltner J,Manninen T,et al.Small molecule inhibitors promote efficient generation of induced pluripotent stem cells from human skeletal myoblasts[J].Stem Cells Dev,2013,22(1):114-123.[5] 马利兵,赵秀娟.动物细胞工程[M].长春:吉林大学出版社,2011.[6] [美]萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:1286-1287.[7] Kotani H,Newton P B,Zhang S,et al.Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy[J].Hum Gene Ther,1994,5(1):19-28.[8] 杨生玺,蒋虹.重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素[J].第四军医大学学报,2005,26(14):261.[9] 单路娟,刘越坚,吴泰华.逆转录病毒滴度测定新方法的实验研究[J].大连医科大学学报,2010,32(4):483-485.[10] 邓虎平,庄然,贾卫,等.人CD22分子胞膜外区D1和鉴定和D2真核表达载体的构建、表达[J].免疫学杂志,2007, 23(5):499-501.[11] Zheng L H,Bao Y L,Wu Y,et al.Cantharidin reverses multidrug resistance of human hepatoma Hep G2/ADM cells via down-regulation of P-glycoprotein expression[J].Cancer Lett,2008,272(1):102-109.[12] 许建.基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用[D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2008.[13] 满朝来,张庆,陈岩,等.逆转录病毒的高效包装及转基因技术平台的建立[J].生物医学工程学杂志,2007,24(5): 1111-1117.。
一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立_陈晓
5 %CO2 下培养 48h 后染色 。 洗去染液 , 光学显微镜下 观察蓝染细胞 , 同上述方法计算转染效率 。
2 结果
2 .1 lacZ-pShutt le 质粒的转染及 X-gal 染色 阴性对 照没有蓝染细 胞 , 而 lacZ-pShut tle 质粒用
磷酸钙法转染细胞有明显的蓝染细胞 , 并且是全细胞 蓝染(图 1)。
(1 .中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室 , 山东省海洋药物重点实验室 , 海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003 ;2 .青岛大学医学部 附属医院呼吸内科 , 山东 青岛 266003)
摘 要 : 利用磷酸钙转染法将 lacZ-pShuttle 质粒导入 HEK 293T 细胞中 , 实验证明 , pH 值 、DNA 纯度 、转 染后培养时间和甘 油休克时 间是影响转染效率的重要因 素 。 转染 后培养 6h 进行 甘油 休克 效果最 佳 , 比培 养 0h 直 接进行 休克 转染效 率升 高 584 .4 %;甘油休克时间为 4.5min 时转染效果最佳 , 比不用甘油休克转染效率升高 130 .8 %。 通过对 影响转染 的几个条件 进 行优化 , 建立了 1 种可以高效转染 HEK 293T 细胞的方法 , 且简便易行 。 关键词 : 磷酸钙转染 ;甘油休克 ;X-g al 染色 中图法分类号 : Q 813.4 文献标识码 : A 文章编号 : 1672-5174(2005)05-807-05
图 1 转染后染色 细胞 Fig .1 Dying cells after transfectio n
2 .2 pH 值和质粒纯度对转染率的影响 HBSP 缓冲 液的 pH 值 在 6 .70 和 7 .10 时 转 染
H EK 293T 细胞的效果不好 , 细胞成活率低 , 有大颗粒 状物体存在(图 2 A , B);pH 值在 6 .96 时转染效果好 ,
钙磷转染法
sly钙磷转染法1．准备：●提前半小时，开空调使室温恢复至270C●解冻试剂盒，plasmid●开紫外●预孵5K BME●备吸管注意：●质粒的交叉污染●试剂盒解冻时不能在370C孵箱中至完全溶解●加不同质粒时，应分别在EP管的几个不同部位加，以确保每种质粒的加样量●混合质粒应分几滴加在不同区域2．在无菌的EP管和15ml管中配制质粒和2X HBS：●取四支EP管，编号，分别加入质粒12ug，37ulCaCl2，加sterile deionized water 至0.3 ml。
●取四支15ml离心管，编号，各加300ul 2X HBS。
●一边振荡（vortex）HBS 的离心管，一边逐渐地滴入相应编号的质粒混合液（滴完）。
从做第一管滴第一滴开始计时。
定30 min。
●做完四管后，避光静置30min（关灯）。
3．定时器计时至18min时，将条件培养基收集至15ml 无菌离心管中。
用不含glutamine的5K BME洗两次CGNs，再往每孔加0.4ml/24well(1.5ml/6well)，随后立即加入相应编号的质粒或质粒混合液25ul/24well(100ul/6well)，将培养板放入培养箱中孵育30 min。
4．吸去培养基，用5K BME洗两遍，加回条件培养基，放回培养箱中，转染20h 后，做Immunocytochemistry。
流程：质粒或质粒混合液逐渐滴入2X HBS 离心管（计时从第一滴开始，定时30min）vortex静置，关灯避光（计时18min时）回收原培养基至15ml离心管，用5K BME洗两次，0.4ml/24well(1.5ml/6well)随后立即加相应编号的质粒25ul/24well(100ul/6well)，分别加在不同位置，混匀培养板放入培养箱中孵育30min（计时）吸去培养基，5K BME洗2次，加回原培养基0.4ml/24well(1.5ml/6well)，放回孵箱中孵20h做ICC 或者luciferase2016-8-3。
C0508 磷酸钙法细胞转染试剂盒说明书
磷酸钙法细胞转染试剂盒
产品名称 磷酸钙法细胞转染试剂盒
包装 >200次
产品简介：
¾ 碧云天生产的磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)，在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上 进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
¾ HEK293或HEK293T细胞，即通常所谓的293细胞，是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达 90%以上；通常很容易达到40-50%左右的转染效率。大多数常见的细胞例如Hela细胞、CHO细胞等也都适合磷酸钙法转 染，但效率比293细胞要略低一些。
¾ 本试剂盒不仅适合于大多数贴壁细胞的转染，也适用于一些悬浮细胞的转染。 ¾ 本试剂盒提供的试剂都经无菌处理，可以直接使用。 ¾ 关于不同的细胞转染试剂的主要特点和差异方面的比较，以及如何选择适当的细胞转染试剂，可参考碧云天的相关网
2. 对于悬浮细胞： a) 离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤一次。 b) 按照上面的步骤c)和d)制备DNA-氯化钙-BBS混合物。 c) 每106个细胞的沉淀，用100微升DNA-氯化钙-BBS混合物重新悬浮，室温放置20分钟。 d) 在一个6孔板孔内加入2毫升完全培养液，然后加入来自上一步的细胞-DNA-氯化钙-BBS混合物，混匀。
e) 在含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。 f) 根据实验要求和磷酸钙对于不同细胞的毒性不同，在4-16小时后离心收集细胞，用PBS洗一次，然后用2毫升完全培
养液重新悬浮细胞，继续培养。 g) 通常在转染约24小时后就可以检测到转染基因的表达。
使用本产品的文献：
转化和转染
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。
载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
钙磷转染法-new
钙磷转染法
1、准备：解冻试剂盒至室温，复温BME，解冻质粒，消毒超净台；
2、取消毒的 1.5 ml EP管加入各处理组质粒、37 μl CaCl2、并加Nuclease-free water至300 ul，混匀；（注：先加质粒，再加water，最后加CaCl2）；另取15 ml 透明离心管中加入300 l 2×Hepes；
3、观察神经元，将条件培养基吸入15 ml离心管并放入孵箱平衡，用BME洗1次并加回BME孵育。
4、一边振荡（votex）含Hepes的15 ml 离心管，一边逐滴匀速加入质粒混合物（大概滴13－15滴）。
5、室温静置4分钟（从做第一管滴第一滴开始计时），肉眼可见颗粒的形成，24孔板每孔加入30 μl质粒-钙磷混合液，然后将培养板放入孵箱孵育。
6、约25分钟后，观察颗粒形成情况，用BME洗2次并加回条件培养基（不能加新鲜完全培养基，因为此时小脑颗粒神经元已经分化成熟，表达NMDA受体，可结合新鲜完全培养基中谷氨酸，使自身中毒），放回孵箱培养。
磷酸钙转染法
通过DNA，氯化钙与磷酸缓冲液混合， 沉淀形成包含DNA且极小不溶的磷酸钙颗 DNA 粒。这些磷酸钙－DNA复合物黏附到细胞 ic kidney (HEK) 293T GFP-Axin ( 3µg ) 2M CaCl2 2×HBS （pH 7.05）
方法
转染前24h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基 DMEM以5×104至2×105细胞/cm2的密度平铺细胞于35mm 组织培养皿上,于含5％～7％CO2的37℃温箱孵育20～24h。 转染前1h换液。 注：为得到较高的转染效率，注意使用指数生长的细胞， 转染时细胞的密度不超过80％。这点很重要。 制备磷酸钙－DNA沉淀：将5µl的DNA与104.5µl的灭菌水混匀， 再加入15.5µl的2M CaCl2，吹吸混匀。将以上钙－DNA溶液与等体 积（125µl ）的2×HBS盐溶液混合, 逐滴加入。迅速弹敲管侧壁混 匀溶液，立即将磷酸钙－DNA悬液逐滴加入至上述单层细胞的细 胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀培养基。 注：培养基会变成浑浊的橘黄色。一旦形成大颗粒沉淀，转染效率 会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。
各种细胞转染方法比较
各种细胞转染方法比较细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic 颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表：转染方法原理主要应用特点厂家及产品DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系Sigma-Aldrich(DEAE-DextranTransfectionKit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高），操作简便但重复性差，有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多GIBCO BRL ，Promega阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。
(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)稳定转染，瞬时转染，所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。
虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine，Lipofectin，LipofectaminePlus，Cellfectin）Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多稳定转染，瞬时转染，所有细胞除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价
一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【摘要】目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293 T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293 T细胞的方法.方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率.采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)mRNA和flag蛋白表达水平.结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后的转染效率明显升高(P<0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24和48 h后,TRAF6 mRNA和flag蛋白表达水平均明显升高(P<0.01).结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】6页(P1177-1181,前插5)【关键词】磷酸钙转染;293T细胞;肿瘤坏死因子受体相关因子6;flag蛋白【作者】华进;程志彬;林春霖;戴起宝;朱广伟【作者单位】福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区,福建福州 350005;福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建福州350005【正文语种】中文【中图分类】Q819目前，将质粒DNA导入动物细胞的方法有很多，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微注射法和磷酸钙共沉淀法等[1]。
一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法
! 6 ! ! 5 ! 5 < 5 6 ! 5 :
5 B ! 8 B : ! B 5 ! B 8 ; B 6 : B 9 ; B =
5 B 7 休克时间对转染率的影响 由结果可见， 甘油休克时间为7 B 8 1 + -时转染效果最
佳， 比不用甘油休克转染效率升高! （表5 ， 图7 ） 。 6 = B ; C
表5 休克时间对转染效率的影响 " # $ % & 5 " ’ & # ( ( & ) * + , -, ( % ) & / , % 2 ’ , ) E * + 1 & * , * ’ & & ( ( + ) + & ) , ( * / # 2 ( & ) * + , D 3 3 休克时间 ／ 1 + F ’ , ) E = ! B 8 6 B = 7 B 8 9 B = : B 8 < B = 转染率 ! 5 6 7 8 9 : ; < ! = > ! ? 2 " / # 2 ( & ) * + , A 6 ／ & ( ( + ) + & ) @ ! = 3
7期
陈
晓， 等： 一种用磷酸钙法高效转染 G H I5 < 6 " 细胞方法的建立
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表! 转染后培养时间对转染效率的影响 , ( * / # 2 ( & ) * + , " # $ % & ! " ’ & # ( ( & ) * + , -, ( ) . % * . / & 0 * + 1 & # ( * & / * / # 2 ( & ) * + , * , * ’ & & ( ( + ) + & ) 3 培养时间 ／ ’ 4 . % * . / & 0 * + 1 & = 5 7 9 ; ! = ! 5 转染率 ! 5 6 7 8 9 : ; < ! = > ! ? 2 " / # 2 ( & ) * + , A 6 ／ & ( ( + ) + & ) @ ! = 3
基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较_李华
研究报告基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较李 华 刘维全＊ 王太一 殷 震＊ (中国医科大学实验动物部,沈阳 110001) 【摘要】 将外源基因导入真核细胞的方法很多。
我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法—脂质体转染法和磷酸钙转染法。
研究结果表明:脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导入体外培养细胞内较理想的方法。
【关键词】 脂质体;磷酸钙类;转染;GFP基因A Comparative Study on the Method of Lipofectionand Calcium Phosphate TransfectionLI Hua,LIU Weiquan,W ANG Taiyi,et al.(Department of Laboratory Animal Science,China MedicalUniversity,Shenyang,110001,China)【Abstract】 To compare the different methods of lip ofection with calcium phosphate,we used them to transfer the GFP report gene into HeLa cell line and the results of the number of fluorescent cells showed that the lipofection is an more ideal method for introduction of foreign gene into the eukaryotic cells because of its higher efficiency and simple operation.【Key words】 liposomes;calcium p hosphate;transfection;GFP gene 当某一基因被克隆后,研究者们总是希望把其导入各种不同类型的细胞中,以便进行其他方面的研究,如基因调控、基因表达以及分离其蛋白质产物等,所有这些研究都必须先将DNA有效地导入细胞之后才能进作者简介:李华,女(1962—),博士,副教授,研究方向:胰岛素及糖尿病基因＊中国人民解放军军需大学基因工程实验室,长春 130062行。
磷酸钙转染——精选推荐
磷酸钙转染：
磷酸钙转染具有转染简单，所需质粒少，转染效率高，转染成本低等特点，我在转染HEK293T细胞时，使用的都是磷酸钙法，转染效率可达到80%，足以满足一般
的实验需要。
实验步骤：
1，分细胞：在转染前一天分细胞，使得转染时细胞的密度在30-70%之间；
2，换液：在转染前3-6小时，给细胞换新鲜培养液，使得细胞生长状态达到最好；6，转染：目的DNA用250mM CaCl2按比例在1.5ml管中混匀(DNA/CaCl2/Well ：4ug/170ul/10cm, 2ug/85ul/6well, 0.5ug/22ul/24well)；随后，在1.5ml管放在震荡器上震荡时，逐滴加入等体积的2XHBS；用枪头将混好的“CaCl2+2×HBS”直接加入到细胞培养皿中，晃动混匀；
４，DMSO处理：加有―CaCl2+2×HBS‖的细胞，在培养箱中37℃培养4-6小时后, 吸去培养基，加入可以覆盖细胞表面的适量10-15% DMSO，室温孵育2分钟；再吸去DMSO，加入新鲜培养基。
一般在转染后的1-2天后收细胞。
溶液配制：
无菌水：高压灭菌，分装
250mM CaCl2：用水配置成2M CaCl2母液，使用时，用水稀释到250mM，室温保存；
2×HBS：50mM HEPES, 280mM NaCl, 1.5mM Na2HPO4, 12mM glucose,
pH 7.10-7.40, 按0.05配置一个梯度，然后分别检测相应的转染效率，最好的一批分装后冻存在-20℃。
两种溶液都通过过滤除菌；
10%-15% DMSO：DMSO用1×PBS稀释即可。
磷酸钙转染
3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
5 Invitrogen Corporation 阳离子脂质体转染指南,2003,(1)
6 颜子颖等译 精编分子生物学实验指南 北京:科学技术出版社,1998,274-328
7 晶美实验新知 晶美生物工程有限公司
8 李华等 基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较,中国实验动物学杂志,2000,10,(2):65-68
3 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection Kit Cat. no. K2780-01
4 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection System Cat. no. 18306-019
xiaoxiangyuyu：我用磷酸钙方法将质粒转染L02、HepG2、3T3、COS 细胞，用免疫组化方法鉴定转染结果，只有第一次作出的为阳性结果，后面均为阴性，想请教大家如何提高磷酸钙法的转染效率，转染歨鄹要注意些什么
丁香园网友gordon83认为：
我觉得做钙转有几点要注意：一是细胞的生长状态，好的培养状态对提高转染效率有很多的左右，我做293T时一般是用接种15~20小时细胞，这时细胞密度为70%左右；二是可以用氯喹处理细胞，这样能提高转染效率，三磷酸钙的颗粒，尽量做的最小，我一般是先把DNA 水和氯化钙先加EP管混匀后，将EP管放在Vortex上将转速调到500rpm，然后逐滴加入HBS.加完后迅速均匀加入到dish中，过7~11小时换液.
RNA干扰步骤_高等教育-实验设计
一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
磷酸钙转染法
张丽君
基本目的
了解细胞培养的常规知识和无菌操作的基本原则,
掌握贴壁细胞复苏、传代和冻存的方法；
了解外源 DNA导入哺乳动物细胞的实验原理, 掌
握磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法。 加深对课堂学习知识的理解和印象，为进一步从 事与本学科有关的科学研究打基础。
细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗
粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特 点。
细胞的储存
低温保护剂：
甘油和二甲亚砜(DMSO)，常用浓度为5-20％。
补加血清：
在冻存液中，另补加10-20％左右的血清。
冻藏温度：
液氮罐，液氮-196℃，可长期保存。 -80 ℃低温冰箱，可保存一年或更长时间。
?显微镜观察过量表达tnfr1实验组和对照组293细胞形态上的差异?用细胞刮子将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻刮下来收集到15ml离心管中?2000rpm离心5分钟?沉淀用1mlpbs重悬转移到15ml离心管中?4000rpm离心3分钟去除上清液?去除上清液加入200lpbs02mgml蛋白酶k重悬细胞再加入200lpbs2np40颠倒混匀冰上作用30分钟期间颠倒数次加入蛋白酶重悬细胞再加入?12000rpm离心2分钟?吸出上清加入1ml乙醇颠倒混匀20c静置10分钟?12000rpm离心10分钟沉淀溶于30l水中加入1lrnasea10mgml37c静置20分钟?在dna溶液中加入6ldna上样缓冲液将全部样品进行12琼脂糖凝胶电泳紫外凝胶成像仪拍照
合而导入细胞。
特点：
转染率高，重复性好。
电穿孔法DNA转染
原理： 利用脉冲电场将DNA导人培养细胞的方法称。 特点： 效率极高，方法简便； 可用于瞬时表达又可用于稳定转化； 受DNA的浓度影响小； 适用于其他技术不能奏效的细胞系．
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磷酸钙转染法
材料：
质粒DNA
指数生长的真核细胞
2 M CaCl2
2×HBS （pH ）
配方:
2×HBS ：900 ml 超纯水中加入NaCl g, KCl g, Na2HPO4 ，Glucose g和HEPES 10 g，调pH至，定容至1 升，过滤（μm 滤膜）后储存于4℃备用。
方法：
1. 细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40~70％）。
将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。
在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。
将等体积2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。
静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2的37℃温箱孵育。
8 h后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，16-40 h观察其转染效率。