负染技术扫描电镜样品制备技术
扫描电镜标本制备技术[资料]
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扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
基础实验——扫描电镜样品制备！
基础实验——扫描电镜样品制备！扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。
扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。
关于生物样品的制备，中洪医学实验君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！1样本要求扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。
但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。
1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。
3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。
4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。
对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
2化学方法制备样品化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。
1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。
亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。
2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。
四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。
这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。
11.第六章 扫描电镜样品制备技术
（2）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固 定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使 玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品 的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体 表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保 存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有 人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在－80度中 干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要 的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常 用。 （3）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味， 无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮 中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的 速度与温度成正比。
D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品 的污染。 E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。 F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。
5、粘托
样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘 到样品托上。 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件： （1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。 （2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。 （3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。 （4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。
1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病ห้องสมุดไป่ตู้一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
扫描电镜样品制备生物技术
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
负染技术、扫描电镜样品制备技术
样品固定、脱水
收集所需细胞
适量0.
立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华
在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100- 200Å)
(用乙醇配制)
PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清 4×6 mm玻片,室温5-10min
2-3%醋酸铀，pH4.
5%、25%、50%各30min)
PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液
吸去多余液体,成膜
PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液
膜未干
细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体oC 1h，梯度酒精脱水
（三）欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用“割断法”暴露观察部位
1.常用的割断法
二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法
样品置入预冷的样品室
可提供足够高的反差
机械稳定性能好；
被检样品纯度和浓度 2.
放气取样
漂洗、冲洗、擦洗，快！
收集所需细胞
适量0.
含水量多的组织(大多数组织) 预处理、 干燥、 导电
5oC，临界压力72.
2.离子溅射法/离子镀膜法
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10 min
一 样品预处理 (一)常规样品
1.取材 5×8 mm， 保护观察面
2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗，快！
3.固定、脱水 同超薄切片
(二) 游离细胞 收集所需细胞
适量0.1%多聚赖氨酸
PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清
4×6 mm玻片,室温5-10min
滴入2-4ml 0.5%戊二醛，4oC 0.5h
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1.取材 5×8 mm， 保护观察面
2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗，快！
3.固定、脱水 同超薄切片
(二) 游离细胞 收集所需细胞
适量0.1%多聚赖氨酸
PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清
4×6 mm玻片,室温5-10min
滴入2-4ml 0.5%戊二醛，4oC 0.5h
用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干
滴染色液，染色3-5min
用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，镜检 (三) 影响因素
1.被检样品纯度和浓度 2.染色液pH 3.操作技巧
扫描电镜生理、导电 含水量多的组织(大多数组织) 预处理、 干燥、 导电
负染技术 阴性反差染色，染色剂不被样品吸收而是沉淀
到样品四周。用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞 成份的检测。
（一）染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小
2-4%磷钨酸，pH6.4-7.0； 2-3%醋酸铀，pH4.2
（二）操作方法 待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10 min
样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态，室温中可升华
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
纯坎烯45oC 20min
室温，坎烯变为固体，
放入真空、升华
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min (用乙醇配制)
吸去多余液体,成膜
PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液
膜未干
细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体
1%戊二醛，4oC 1h
PBS漂洗，1%OsO4，4oC 1h，梯度酒精脱水
（三）欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用“割断法”暴露观察部位
1.常用的割断法
二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法
立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华
5.临界点干燥法 干燥效果最好，应用最广泛 ⑴原理
物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也 可复相存在。
临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面 张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。
液态CO2临界温度：31.5oC，临界压力72.8kg/cm2
⑵方法
样品固定、脱水 中间液(醋酸异戊酯)置换
样品置入预冷的样品室 注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 (一)目的
避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 (二)方法
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100-
200Å ) 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率(≤100Å )； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
2.冷冻割断的操作
TF-1冷冻割断仪
简易割断器
注入液氮
固化包埋
割断
溶化冲洗
3.标本制作法
取 材 (1×1×5mm) 、 前 固 定 (1%OsO4 ， 4oC 1h) 浸 洗 (0.1M PBS ， 10min×3次 )
DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min)
冷冻割断
后固定(0。1%OsO4，4oC 30min)
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少 3.导电染色法/组织导电技术(TOT)
利用金属盐(碘化甲、单宁酸)对生物体蛋白质、脂肪 的结合作用
扫描电镜生物样品制备的基本程序
双 蒸 水 洗 涤 30min ， 2% 单 宁 酸 15min×2 次 ， 双 蒸 水 洗 涤 30min 1%OsO4，4oC 30min， 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥，克服表面张力的影响， 保存样品表面微细结构 1.自然干燥法
无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法