生物人教版选修1课件：专题5 3 血红蛋白的提取和分离

课题3
血红蛋白的提取和分离
蛋白质分离的原理和方法
[自读教材· 夯基础]
1．蛋白质分离的理论依据
形状和大小 ①分子的__________ 电荷 的性质和多少 ②所带______ 蛋白质特性的差异③溶解度 ④吸附性质 亲和力 ⑤对其他分子的_______
2．分离的方法 (1)凝胶色谱法：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中 洗脱出来的是__________，原因是____________ _____________________________________。 (2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d 位置相当于多孔板的结构可由_________________ 替代。 (3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因 是__________________________________________________ __________________________________________________。
(2)电泳：
迁移 的过程。 带电粒子 在电场的作用下发生_____ ①概念：指_________ pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离 ②原理：在一定的____ 正电或负电 ，在电场的作用下，这些带电分子会向着 基团会带上___________ 相反 的电极移动。 与其所带电荷_____
③影响电泳速率的因素：
[解析]
本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，
可按以下思路进行分析作答。 (1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相对分子质 量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动， 路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部 通道，路程长，速度慢。 (2)注意事项：①凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆 盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。②凝胶色谱柱的装 填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液 中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
操作
目
的
红细胞洗涤
血红蛋白释放
去除杂质，如血浆蛋白
使红细胞破裂，释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液
透析
经过离心使血红蛋白与其他杂质分离
除去样品中相对分子质量较小的杂质
纯化
除去相对分子质量较大的蛋白质
3．实验结果分析与评价 (1)对血液样品处理后样品发生的变化： ①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化 碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。 ②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。 ②红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细 胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。 (2)判断装填的凝胶色谱柱成功与否：
2． 在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？
提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中 含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破 裂以释放血红蛋白。
3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有 什么意义？
提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以 通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白 的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
③装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。④样品的加入 和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。 [答案] (1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通 (2)尼龙网
道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快 和尼龙纱 效果 范围
在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯， ①方法检查凝胶是否装填均匀 加入大分子的有色物质，观察色带移动情况
若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好 ②成功的标若色谱柱内出现纹路或是气泡，可轻轻 准及调整 敲打柱体以消除气泡，若消除不了则 重新装柱 (3)对分离效果的判断： ①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓 慢流出，则装填成功，分离操作正确。 ②若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离 效果不好，装填不成功。
留在袋内。 3．纯化 (1)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。
(2)过程：
4．纯度鉴定
SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳。 在鉴定的方法中，使用最多的是____________________
1． 洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？
提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于 破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就 可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
带电性质 差异 a._________ 产生 大小不同――→ 各种分子b.分子本身_____ c.分子本身_____ 形状 不同
实现 迁移速度 不同的_________ ――→ 各种分子的分离
聚丙烯酰胺 琼脂糖凝胶 电泳和___________ ④方法：常用的电泳方法有___________
2．粗分离——透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定 量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。
相对分子质量较小 的杂质除去。 (2)目的：将__________________ 大分子物质 保 (3)原理：透析袋能使小分子 ______自由进出，而将____________
③原理：相对分子质量较小的蛋白质容易 ____进入凝胶内部的通 道 ， 路 程 _____ 较长 ， 移 动 速 度 较 慢 ， 通 过 凝 胶 的 时 间 _____ 较长 ；
相对分子质量较大 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道， __________________ 只能在凝
较短 。 较短 ，移动速度较快，通过凝胶的时间_____ 胶外部移动，路程_____
_____ 凝胶 电泳。
3．缓冲溶液
酸和碱 对溶液pH的 (1)作用：在一定范围内，抵制外界的_______
影响，维持pH基本不变。
缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节 (2)配制：由1～2种_______ 使用比例 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 缓冲剂的_________
[跟随名师· 解疑难] 1．凝胶色谱法 (1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通 道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。 (2)原理：
②加入 SDS 的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条 肽链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS 复合物，SDS 所带负电荷 的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间 的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分对分子质量通常用SDS聚丙烯
酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳 定性强，可用检测仪直接测定。
[特别提醒] 如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过 滤后再加样；洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之 一，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱 上的压力恒定。
凝胶电泳法原理分析
[例1] 右图表示对某蛋白质溶液进行SDS—聚 丙烯酰胺凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色 素)，下列相关叙述不 正确的是 ． ( )
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带 电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动 B．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决 于其所带净电荷多少 C．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决 于相对分子质量的大小 D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只 有一种
实验操作
[自读教材· 夯基础]
1．样品处理 (1)红细胞的洗涤：
杂蛋白 ，以利于后续步骤的分离纯化。 ①目的：去除_______
②过程：
(2)血红蛋白的释放：
血红蛋白 。 ①目的：使红细胞破裂释放_________
②过程：
分离 (3)分离血红蛋白溶液混合液离心 ―→ 用滤纸过滤除去
脂溶性沉淀层 ―→分液漏斗中_____ 静置 片刻―→分离出下层 _____________ 红色透明液体 。 ______________
[解析]
蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或
负电，在电场中发生迁移。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳所加 的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本 身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种 蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。 [答案] B
[跟随名师· 解疑难]
1．分离血红蛋白溶液的结果
溶 液 分 为 4 层
第1层最上层：甲苯层无色透明 第2层中上层：脂溶性物质沉淀层 白色薄层固体 第3层中下层：血红蛋白的水溶液层 红色透明液体 第4层最下层：杂质沉淀层暗红色
2．样品处理、分离与纯化的目的不同
项目
直径大小 运动方式 运动速度
相对分子质量大
相对分子质量小
大于凝胶颗粒空隙直 小于凝胶颗粒空隙直径， 径，被排阻在外面 可以进入颗粒内部 垂直向下移动 较快 无规则扩散进入凝胶颗粒 较慢
运动路程 较短 洗脱次序 先从凝胶柱洗脱出来
较长 后从凝胶柱洗脱出来
2．电泳的常用方法 (1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以， 各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、 分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳： ①凝胶形成：
蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主 要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除 了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、 形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。
凝胶色谱法的原理与操作
[例2] 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，
由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质 有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生 物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但 应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据 图回答问题：