纳米级酶固定化技术的发展
磁性纳米粒子固定化酶技术研究进展
磁性纳米粒子固定化酶技术研究进展陈静;冷鹃;杨喜爱;廖丽萍;肖爱平;刘亮亮【摘要】磁性纳米粒子因兼具磁学特性和纳米材料独特性能,被广泛应用于各个领域.就磁性纳米粒子的种类、特性、制备和表面修饰四个方面展开介绍,综述了脂肪酶、漆酶、淀粉酶及其复合酶等生物酶固定化酶技术的最新研究动态,针对磁性纳米粒子在固定化酶技术的研究应用现状进行了总结,以期为磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2017(007)004【总页数】6页(P284-289)【关键词】磁性纳米粒子;脂肪酶;漆酶;淀粉酶;固定化酶【作者】陈静;冷鹃;杨喜爱;廖丽萍;肖爱平;刘亮亮【作者单位】中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205【正文语种】中文酶是具有生物催化功能的高分子物质，具有高效性、专一性、反应条件温和、无污染等特点[1]，在食品加工、药学和医学等研究领域中有着巨大的应用潜力。
然而，大多数酶是蛋白质，其活性易受温度、pH等因素影响，且与底物产物的混合物不利于其回收，难以实现产物的分离纯化和连续化生产[2]。
20世纪60年代迅速发展起来的固定化酶技术很好的解决了这些问题，有效提高了酶的利用率，并实现了产业化发展。
其中，酶的固定载体和技术研究一直是酶固定化研究的核心问题，重点是寻找新的载体，确保固定后的酶保持其催化活性、催化特性和稳定性，同时，可实现高负载量和复合酶链式反应[3]。
近几年，新型载体和技术有：交联酶聚集体[4]、“点击”化学技术[5]、多孔支持物[6]和以纳米粒子为基础的酶的固定化[7]等。
纳米粒子作为酶固定化的新型载体，具有良好的生物相容性、比表面积大、颗粒直径小、较小的扩散限制、较高的载酶量及在溶液中稳定存在等优点[8]。
四 固定化酶的性质
合成方法
合成方法是利用天然高分子材料包埋 磁性微粒,或在磁流体存在下进行聚合 反应, 均可得到纳米级的磁性微球
2 其它新型载体
导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶 电极类生物传感器的制备。 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶时, 条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。 N - 异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得 到温敏性水凝胶载体, 用于固定嗜热菌蛋 白酶时可实现均相催化和异相分离的统一
固定化后酶稳定性提高的可能原因
固定化后酶分子与载体多点连接．可防止 酶分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合， 由于酶失去了分子间相互作用的机会，从 而抑制了降解。
(三)固定化酶的最适温度变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综 合结果。 由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温 度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤 亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度 为80℃，比固定化前提高了30℃。 也有的固定化后会降低 固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的 影响。
四 固定化酶的性质
由于固定化常常是一种化学修饰，酶本身 的结构必然受到扰动，同时酶固定化 后．其催化作用由均相移到异相，由此带 来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质 造成的分配效应等因素必然对酶的性质产 生影响。
(一)固定化后酶活力的变化
多数情况下比天然酶小，其专一性也能发 生改变。 例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋 白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活 力的30％，而对低分子底物苯酞精氨酸－ 对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以， 一般认为高分子底物受到空间位阻的影响 比低分子底物大。
酶固定化技术的方法
酶固定化技术的方法
酶固定化是将酶与载体物质结合在一起，以增强酶的稳定性和重复使用性的技术。
常见的酶固定化方法包括以下几种：
1. 吸附固定化：将酶溶液与载体物质（如活性炭、陶瓷颗粒）接触，酶分子通过吸附作用与载体物质结合。
2. 凝胶固定化：将酶溶液与凝胶物质（如明胶、琼脂）混合，酶通过物理交联或化学交联与凝胶物质牢固结合。
3. 包埋固定化：将酶溶液与聚合物物质（如聚乙烯醇、明胶）混合，然后通过共混或交联反应，使酶被包裹在聚合物内部。
4. 共价固定化：将酶溶液与活性基团多的载体物质（如硅胶、纳米颗粒、聚乙二醇）反应，形成酶与载体物质之间的共价键连接。
5. 薄膜固定化：在载体表面形成一层薄膜，然后将酶与薄膜固定在一起，常见的方法有溶液浸渍、层层自组装等。
这些方法各有优缺点，选择合适的固定化方法应根据具体的酶性质、应用需求和实际操作条件进行综合考虑。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
酶的固定化研究及其应用
酶的固定化研究及其应用酶是一种高效的生物催化剂，具有广泛的应用前景，但自由酶的使用存在着许多问题，如易失活、难回收、低稳定性等。
为克服这些缺陷，科学家们研究出了酶的固定化技术，即将酶固定在载体上，形成固定化酶。
固定化酶具有多种优点，如稳定性高、重复使用性好、反应率高等，因此被广泛应用于产业、医药等领域，在此进行探讨其固定化研究及应用。
一、固定化酶的分类将酶固定在载体上的方法有很多种，根据载体的不同，固定化酶可分为微生物固定化酶、无机载体固定化酶和有机载体固定化酶三类。
微生物固定化酶，即将酶固定在菌体或细胞内的方法。
这种方法容易操作，且菌体或细胞具有较好的稳定性，能够保护酶的活性。
常见的微生物固定化酶有酵母固定化酶、乳酸菌固定化酶等。
无机载体固定化酶，即将酶固定在无机材料或人工合成材料上的方法。
与微生物固定化酶相比，无机载体的操作难度较大，但无机载体具有很强的机械强度和稳定性，不容易被生物体攻击。
最常用的无机载体为硅胶、氧化铝、氧化锆等。
有机载体固定化酶，即将酶固定在有机高聚物上的方法。
与无机载体相比，有机载体具有更好的生物相容性和更大的比表面积，能够与底物充分接触，提高反应效率。
常用的有机载体有聚乙烯醇、聚丙烯酸、胶原蛋白等。
二、固定化酶的优点1.稳定性高：固定化酶相对于自由酶，在温度、pH值等条件变化时，具有更好的稳定性，不易失活，能够保持较高的催化效率。
2.反应率高：由于固定化酶在载体上固定稳定，不受外界环境的影响，酶底物反应能力更强，反应率更高。
3.反应可重复使用：固定化酶具有独特的再利用性，可以进行多次循环反应，避免了由于自由酶反应后分离难的困扰。
4.反应得率高：固定化酶可以在低酶浓度、低温度、低反应时间下实现高得率反应，提高了反应效率。
三、固定化酶的应用1.食品工业：在食品工业中，利用固定化酶可将大分子物质转化为小分子物质，例如将葡萄糖转化为果糖等，使食品的甜度更适合人们口感，提高了食品品质。
酶固定化技术用载体材料的研究进展
酶固定化技术用载体材料的研究进展杨勇 李彦锋3 拜永孝 易柳香 夏春谷#(兰州大学化学化工学院功能有机分子化学国家重点实验室生物化工及环境技术研究所 兰州 730000;#中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室 兰州 730000)摘 要 酶的固定化是生物技术中最为活跃的研究领域之一。
作为固定化酶技术的重要组成部分,载体的结构及性能在很大程度上直接影响着所得固定化酶的催化活性及操作稳定性。
综合性能优良的载体材料的设计与制备是固定化酶技术领域的一个非常重要的研究内容。
通过对传统材料的改性和新型载体材料的研究开发,必将促进固定化酶在各个领域的广泛应用。
本文综述了近年来国内外有关固定化酶载体材料的研究现状和发展趋势。
关键词 固定化酶 载体材料Progress in C arrier Materials Employed in Immobilization of E nzymesY ang Y ong,Li Y an feng3,Bai Y ongxiao,Y i Liuxiang,X ia Chungu#(C ollege of Chemistry and Chemical Engineering,S tate K ey Laboratory of Applied Organic Chemistry,Institute of BiochemicalEngineering&Environmental T echnology,Lanzhou University,Lanzhou730000;#S tate K ey Laboratory for Ox o Synthesis and Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou730000)Abstract Enzymes imm obilization is one of the m ost active research fields in biotechnology.As an im portant part of imm obilized enzymes,carrier materials affect the activity of catalysis and operation stability greatly.The design and preparation of carrier materials with excellent integration per formances will be one of the m ost significant researches for the development of imm obilized enzymes in the future.Im provement of traditional materials,designing and exploiting new carrier materials will prom ote the application of imm obilized enzymes in various fields.The recent research progress in carrier materials for imm obilized enzymes are reviewed in this paper.K ey w ords Imm obilized enzyme,Carrier materials酶作为一种特殊的生物催化剂,具有较高的选择性和催化效率、反应条件温和、催化活性可以调节控制等优点。
生物酶制备方法
生物酶制备方法
生物酶制备方法是指在一定的条件下，通过特定的工艺流程将酶基因进行表达、克隆、诱导表达，从而获得具有催化活性的蛋白质。
以下简要介绍几种常见的生物酶制备方法：
1. 发酵法：通过微生物发酵，利用其自身基因表达的蛋白酶
基因进行表达，再经过分离、纯化得到生物酶。
这种方法具有成本低、产量高等优点，但制备的酶种类有限。
2. 重组DNA技术：通过重组DNA技术将外源基因克隆到表达
载体中，然后进行诱导表达。
这种方法能够制备出许多不同的生物酶，包括用于催化反应、蛋白质修饰和组织工程的酶。
其中，诱导
表达的方法有多种，如温度诱导、添加诱导剂等。
3. 层析分离纯化法：在酶基因表达后，使用层析分离纯化法
将所需的生物酶分离、纯化出来。
这种方法具有操作简单、效率高、成本低等优点，适用于大规模生产。
4. 酶固定化技术：将酶固定在反应器中，使其能够连续长时
间地催化反应。
这种方法可以提高酶的稳定性，减少浪费，适用于
工业生产。
常用的固定化技术包括吸附法、包埋法等。
5. 纳米技术制备：利用纳米技术制备纳米级别的生物酶颗粒，具有高活性、高稳定性等优点。
这种方法适用于特殊用途的生物酶
制备，如组织工程、药物输送等。
总之，生物酶制备方法多种多样，每种方法都有其优缺点。
在实际应用中，应根据具体需求和条件选择合适的制备方法。
同时，
随着技术的不断进步，未来有望开发出更多高效、环保的生物酶制
备方法。
固定化酶的研究进展
固定化酶的研究进展
固定化酶以其优越的特性，在物理化学过程中发挥着重要的作用。
近年来，固定化酶的研究已取得了重大突破，为解决各种化学反应问题提供了新的思路和解决方案。
1．固定化酶的研究历史
固定化酶的研究可以追溯到1899年，当时海尔士和罗斯证明可以将酶结合到珠粒或陶瓷体中。
之后，1904年，韦伯提出了将酶固定在改性双氧水Gel上的概念，这标志着固定化酶研究正式开始。
在后续几年中，研究人员们利用不同类型的支撑体，研究固定化酶的活性及固定方法，例如改性的石英粉和橡胶等。
1960年代，随着计算机和分子生物学的发展，人们对固定化酶的了解加深了，同时，也解决了以往无法实现的合成反应问题，这大大促进了细胞工程技术的发展。
这一时期的固定化酶研究主要集中在对酶结构和活性的研究，以及利用多种体内诱导因子来实现酶固定化的方法，例如培养基、氯仿等。
2．固定化酶的进展
随着生物技术的发展，固定化酶的应用可以说是前所未有的。
今天，科学家们可以利用先进的技术，将多种酶和酶-活性物质结合在一起，形成不同功能的复合酶体，以提高它们的反应活性。
近年来，固定化酶的研究重点也在拓展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第7卷 第7期 2007年4月167121819(2007)721411205科 学 技 术 与 工 程
ScienceTechnologyandEngineeringVol17 No17 Apr12007
Ζ 2007 Sci1Tech1Engng.
综 述 化工技术纳米级酶固定化技术的发展
刘仁霖 罗 晖 常雁红3 孙春宝(北京科技大学环境工程系,北京100083)
摘 要 对酶的纳米级固定化技术的研究现状进行了综述,按纳米级固定化技术的发展阶段将其划分为三类,并比较了这三类纳米级固定化法的优缺点,在此基础上对纳米级酶固定化技术的发展方向进行了分析。关键词 酶 磁性纳米载体 固定化 超顺磁性中图法分类号 TQ46818 文献标识码:A
酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,使之仍能进行其特有的催化反应,并可回收及重复使用的一类技术。按其性质分,主要有四种,即包埋法、交联法、吸附法及共价法[1]。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时,还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点[2]。酶的催化效率及选择性在很大程度上取决于所使用酶的比表面积和几何形状;如不考虑其它因素,则粒径越小,比表面积越大,催化剂的效率就越高[3]。传统的固定化酶粒径一般为(011～10)mm。由于受到固定酶量少和较大传质阻力的影响,这类固定化酶的催化效率比较有限。而纳米级固定化的酶具有比表面积大、传质阻力小、固定酶量多和催化效率高等优点,这使得酶的纳米级固定化技术[4]受到越来越广泛的关注。对酶的纳米级固定化技术的研究主要包括以下三个方面:(1)利用反胶团为酶模拟“自然环境”,将酶限制在反胶团中进行催化反应,反应结束通过膜 2006年11月22日收到北京市科技新量计划(2006B22)资助第一作者简介:刘仁霖(1981—),男,重庆市人,硕士研究生,研究方向:生物化工。3通信作者简介:常雁红,女,E-mail:yhchang0512@yahoo.com.cn。反应器将酶和表面活性剂截留下来回收利用;
(2)利用反胶团作为“微反应器”(microreactor)进行
纳米级的聚合,以所得纳米高分子材料作为固定酶的载体;(3)高分子聚合物中引入纳米级磁核,得到可在磁场下快速分离的磁性高分子微球载体,并进行酶的固定化。
1 反胶团对酶的固定化反胶团(束)[(10～100)nm]是表面活性剂溶解在非极性溶剂中形成的、围绕一个极性核的纳米级聚集体,是一种低水含量的油包水(W/O)微乳液。与普通乳状液(几百甚至上千纳米以上)不同,
反胶团溶液是透明的、热力学稳定的体系[5]。20世纪80年代末,Haering等人[6]发现W/O
微乳液体系可以发生胶凝作用,并对微乳液凝胶性质进行了初步表征。90年代初,Rees等人[7]开始尝试利用这一现象来固定脂肪酶,并对固定化酶的酶学性质进行了大量研究之后,便有用微乳液凝胶固定化脂肪酶进行有机相合成与对应体拆分的研究报道。反胶团(束)能在分子水平上把酶分散在有机介质中,亲水性的酶定位在极性水腔中,周围是一个水层和一个表面活性剂层,酶不与有机溶剂直接接触,所以避免了失活;而相对疏水的酶,则定位在水 科 学 技 术 与 工 程 7卷
池与表面活性剂之间的界面上。因为界面的疏水性小于水池,这样在此体系中大多数酶能保持催化活性和稳定性,有的甚至表现出超活性(superactivity),使得反胶团技术也被看成是生物催化剂的固定化新方法[8]。这种固定化方法与传统固定化法不同的是它没有严格意义上的载体。随着反胶团技术发展和酶催化反应研究不断深入,一个新的研究领域———胶束酶学(Micellarenzymology)开始产生和兴起[9]。目前,胶束酶学大多数研究主要集中在反胶束定位和结构、酶催化反应动力学特征、酶催化活性和稳定性等基础研究方面,但少量研究已开始向应用方面过渡,如辅酶的再生、脂肪酶的催化反应、肽和氨基酸的合成、高分子材料的合成以及有毒物质的降解等[10],其中应用最广泛的当属脂肪酶的催化反应[11—13]。反胶团作为一种微乳体系对酶的固定化具有诸多优势:(1)组成的灵活性。大量的不同类型的表面活性剂、有机溶剂甚至是不同极性的物质都可用于构建适于酶反应的反胶团体系。(2)热力学稳定性和光学透明性。反胶团是自发形成的,因而不像一般乳化液那样需要机械混合,有利于规模化制备。(3)反胶团有非常高的界面积/体积比,远高于有机溶剂/水两相体系,使底物和产物的相转移变得极为有利。(4)产物回收可通过相调变实现。反胶团的相特性随温度而变化,这一特性可用于产物回收。当然,作为一项新技术,反胶团固定化法还有很多有待解决的问题:(1)反胶团所构成的微环境不利于大分子底物的扩散,其应用领域有一定局限性;(2)各成分的选用与酶活密切相关,如果成分选用或配比不当,不但不能提高酶的活性,反而会使酶活降低;(3)产物易被表面活性剂污染,不易做到连续生产。2 纳米级有机或无机载体对酶的固定化固定化酶常用的有机高分子载体材料一般可分为两大类[14]:天然高分子材料和人工合成高分子材料。第一类载体材料一般无毒性,传质性能好,但强度较低,在厌氧条件下易被微生物分解,寿命较短;第二类载体一般强度较大,但传质性能较差,在进行细胞固定时对细胞活性有影响。这些新载体的种类很多,而且经过人们不断地研究开发,已有许多人工合成的高分子材料应用于酶的固定化。制备纳米级高分子载体的常用方法是利用反胶团进行聚合,反胶团在这里扮演的是“微反应器”(microreactor)的角色。由于反胶团是纳米级的,所
以在其中进行聚合反应有利于控制高分子产物的粒径大小以及分布。人们利用反胶团聚合法制备纳米级高分子载体,然后再通过共价交联或吸附的方法对酶进行固定化。郭刚军等[15]以碘酸盐为氧化剂,通过氧化2迈克尔加成反应,由邻苯二酚和4,4’2亚甲基苯胺合成了一种新的功能聚合物———芳香胺2邻醌聚合物。这种聚合物表面由分布均匀的纳米颗粒和孔穴构成。由于这种聚合物分子含有疏水骨架、羰基和胺基的有序分布,以及独特的纳米微观颗粒和孔穴结构,使其成为吸附法固定化酶的良好载体。除了对有机高分子材料以外,人们还对无机纳米载体进行了制备及研究。如纳米微球[16—18]、纳米介孔材料[19—21]和纳米纤维[22—24]等。
3 纳米磁性微球对酶的固定化纳米级的固定化酶的载体粒径小,分离十分困难,如果能将纳米高分子载体带上磁、电等物理特性,使其能在磁场或电场中分离,将大大拓展酶的纳米级固定化载体的适用范围。而这也是近来研究者普遍关注无机2有机混合材料载体,即磁性高分子微球的原因。磁性高分子微球是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合起来形成的、具有一定磁性及特殊结构的微球。因磁性高分子微球同时兼具高分子微球的众多特性和磁响应性,不仅能通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基(如-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH等),还能在外加磁
场下方便、迅速地分离。因此,自20世纪70年代以来,磁性高分子微球作为一种新型的功能材料,在磁性材料、生物医学(临床诊断、靶向药物、酶标)、细胞学(细胞标记、细胞分离等)和生物工程(酶的固
2141 7期 刘仁霖,等:纳米级酶固定化技术的发展
定化)以及分离工程等诸多领域显示出强大的生命力[25]。磁核的化学制备方法主要有几种:共沉淀法[26]、沉淀氧化法[27]、乳液法[28]和溶胶凝胶法[29]。共沉淀法制备的纳米Fe3O4粒径分布范围宽、易团聚、重现性差;乳化法制备的纳米Fe3O4晶型不均一。微乳液法制备纳米材料是最近几年发展起来的新方法,由于粒子表面包裹一层表面活性剂分子,使粒子间不易聚结;同时,通过选择不同的表面活性剂分子,可对粒子表面进行修饰。油包水(W/O)型微乳液中的水核是一个“微型反应器”,化学反应被限制在水核内,故最终得到的微粒粒径将受到水核大小的控制,从而可以控制微粒的大小。当制备出来的磁核粒径达到20nm以下时,就具有了超顺磁性;粒径为13nm时超顺磁性最佳。这样的磁核在外加磁场撤去后,微球不再具有剩磁,且易于回收和在溶液中重新分散。磁性高分子微球的制备方法主要有:包埋法[30]、单体聚合(乳液聚合[31]、分散聚合[32]、悬浮聚合[33])和化学转化法[34](原位法)。按以上方法制备出来的磁性高分子微球的组成结构可以分为三类[35]:一类是由磁性材料组成核,聚合物组成壳层,即核壳型[36,37](酶的固定化载体以此类为多);另一类是将聚合物作为核,磁性材料作为壳,即壳核型[38,39](一般被用于医药方面,如靶向药物);还有一种是内外层是聚合物,中间是磁性材料的多层微球[40,41]。磁性微球对酶的固定化可通过以下几种途径实现[42]:(1)直接的物理吸附,或用双功能基试剂交联(如戊二醛)[43]。(2)吸附非特定蛋白质在磁性微球上,用戊二醛交联后,将酶共价偶合到蛋白质上[44]。(3)硅烷化的磁性微球通过共价偶合[45]。(4)过渡金属(如Ti、Zr)与酶的螯合作用[46]。(5)带有可与酶共价偶合的功能基的聚合物作为磁性微球的壳层[47]。在固定化酶体系中,利用磁性高分子微球作为结合酶的载体有着很多优点[48]:①有利于固定化酶从反应体系中分离和回收,操作简单、易行;②对于双酶反应体系,当一种酶的失活较快时,就可以用磁性材料来固载另一种失活较慢的酶,回收后可反复使用,降低成本;③利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向,替代传统的机械搅拌方式,提高固定化酶的催化效率;④可以改善酶的生物兼容性、免疫活性、亲疏水性;⑤提高酶的稳定性。
4 展望反胶团固定化法是三类纳米级固定化法中制备过程最简单的,其它两种方法需要进行一系列的化学反应才能制备出固定化载体,还要通过交联、吸附等多种手段对酶进行固定。所以,反胶团固定化法的成本相对较低,但其可控性较差,酶和产物的回收相对较难。要实现酶的重复利用及产物分离,就必须构建合适的反应器,如膜反应器就是一种很有前景的反胶团固定化酶的反应器,可以将酶保留在反应器内,并有实现连续化操作的潜力;但这方面的研究还很少,今后的研究方向主要包括[49]:(1)探索加
入新的作用,如电场、磁场等,以改善膜的渗透性能;
(2)新的反胶团体系及反应物系的开发;(3)各种反
胶团体系在膜反应器中的应用;(4)改变膜两侧介质性质以优化反应器操作;(5)膜反应器连续操作的动力学研究。纳米级有机载体和无机载体的优势是表面富含活性基团,但制备载体以及对酶进行固定化的工艺相对复杂。虽然固定化载体的粒径越小比表面积越大,有利于固载酶量的增加,但同时也增加了分离回用的难度,可控性仍然需要通过研究提高。所以,人们开始普遍关注无机2有机复合功能材料研制[50]。磁性高分子微球作为一种新型的复合功能材料,在纳米级固定化载体中有着显著的性能优势和巨大的应用潜力。它可控性好,反应的时候用磁场控制酶在反应釜中的走向,可以替代机械搅拌;