Akt特异性抑制剂鱼藤素对前列腺癌PC_3细胞生长的影响_陈洪波

NJA中华男科学杂志National Journal of Andrology Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi 2013，19（6）：501－505http ：//www．androl．cn·论著·Basic Research（基础研究）Akt 特异性抑制剂鱼藤素对前列腺癌PC -3细胞生长的影响陈洪波1，胡晓辉1，江克华1，朱圣亮1，赵纯雄1，袁巍1，兰勇1，陈苏1，袁红纲2，宋兴福2，王艳林3（1．恩施州中心医院泌尿外科，湖北恩施445800；2．三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌443003；3．三峡大学分子生物学研究所，湖北宜昌443002）【摘要】目的：观察Akt 抑制剂鱼藤素对前列腺癌PC-3细胞株的抑制作用并探讨其可能的作用机制。

方法：用MTT 法检测鱼藤素对PC-3细胞的增殖抑制率；流式细胞术（FCM ）检测鱼藤素对细胞周期的影响；RT-PCR 检测细胞中小鼠双微体2（MDM2）、糖元合成酶激酶3β（GSK3β）mRNA 表达的变化；Western 印迹法检测MDM2、GSK3β蛋白表达的变化。

结果：MTT 法显示，10、100、500、1000nmol /L 的鱼藤素作用于前列腺癌PC-3细胞24、48、72h 后，对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制率分别为（91．10ʃ3．75）%、（86．39ʃ1．16）%、（79．51ʃ2．63）%；（82．46ʃ3．65）%、（76．84ʃ0．97）%、（69．69ʃ2．30）%；（81．46ʃ0．41）%、（75．56ʃ1．12）%、（54．07ʃ3．21）%；（66．77ʃ2．82）%、（58．22ʃ0．35）%、（39．34ʃ2．40）%，均能显著抑制其增殖（P 均＜0．01）；FCM 检测显示各浓度的鱼藤素使前列腺癌PC-3细胞周期阻滞在G0/G1期比例增加［（53．4ʃ2．3）%、（62．4ʃ2．2）%、（63．6ʃ1．1）%、（65．0ʃ0．3）%、（66．5ʃ1．9）%，P 均＜0．01］，S 期细胞比例减少［（26．9ʃ1．7）%、（14．7ʃ2．4）%、（11．1ʃ5．2）%、（5．8ʃ1．1）%、（7．0ʃ0．6）%，P 均＜0．01］；RT-PCR 和Western 印迹法结果显示鱼藤素上调了GSK3βmRNA 和蛋白的表达水平，而下调了MDM2mRNA 和蛋白的表达水平。

结论：Akt 抑制剂鱼藤素能抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖，其机制可能与影响Akt 信号通路下游分子GSK3β、MDM2的表达相关。

【关键词】前列腺癌；PC-3细胞；鱼藤素；小鼠双微体2；糖元合成酶激酶3β中图分类号：R737．25文献标志码：A文章编号：1009-3591（2013）06-0501-05*Inhibitory effect of Akt inhibitor deguelin on the growth of PC-3prostate cancer cellsCHEN Hong-bo 1，HU Xiao-hui 1，JIANG Ke-hua 1，ZHU Sheng-liang 1，ZHAO Chun-xiong 1，YUAN Wei 1，LAN Yong 1，CHEN Su 1，YUAN Hong-gang 2，SONG Xing-fu 2，WANG Yan-lin 31．Department of Urology ，Central Hospital of Enshi Prefecture ，Enshi ，Hubei 445800，China ；2．The First School of Clinical Medicine ，China Three Gorges University ，Yichang ，Hubei 443003，China ；3．Institute of Molecular Biology ，China Three Gorges University ，Yichang ，Hubei 443002，China【Abstract 】Objective ：To study the inhibitory effect of Akt inhibitor deguelin on PC-3human prostate cancer cell lines and its possible mechanism．Methods ：PC-3human prostate cancer cells were cultured in deguelin at the concentrations of 10，100，500and 1000nmol /L for 24，48and 72hours ，respectively．Then the inhibitory effect of deguelin on the proliferation of the PC-3cells was determined by MTT assay and that on the cell cycle was detected by flow cytometry．The expression levels of MDM2and GSK3βmRNA were measured by RT-PCR and those of MDM2and GSK3βproteins by Western blot．Results ：At 24，48and 72hours ，the·105·*作者简介：陈洪波（1972-），男，湖北恩施市人，副主任医师，本科，从事泌尿系肿瘤专业。

通讯作者：江克华，Email ：tjjkh@sina．cominhibition rates of deguelin on the proliferation of the PC-3prostate cancer cells were（91．10ʃ3．75），（86．39ʃ1．16）and（79．51ʃ2．63）%at10nmol/L，（82．46ʃ3．65），（76．84ʃ0．97）and（69．69ʃ2．30）%at100nmol/L，（81．46ʃ0．41），（75．56ʃ1．12）and（54．07ʃ3．21）%at500nmol/L，and（66．77ʃ2．82），（58．22ʃ0．35）and（39．34ʃ2．40）%at1000nmol/L，all with statistically significant differences from the control group（P＜0．01）．Deguelin at10，100，500and1000nmol/L increased the cell cycles blocked in the G0/G1phase（［62．4ʃ2．2］，［63．6ʃ1．1］，［65．0ʃ0．3］and［66．5ʃ1．9］%，P＜0．01）and re-duced the percentage of the S-phase cells（［14．7ʃ2．4］，［11．1ʃ5．2］，［5．8ʃ1．1］and［7．0ʃ0．6］%，P＜0．01）．RT-PCR and Western blot showed markedly up-regulated expressions of GSK3βand down-regulated expressions of MDM2mRNA and proteins in the PC-3cells treated with deguelin．Conclusion：Akt inhibitor deguelin can inhibit the proliferation of PC-3human prostate cancer cells by affecting the down-stream signal molecules GSK3βand MDM2in the Akt pathway．Natl J Androl，2013，19（6）：501－505【Key words】prostate cancer；PC-3cell line；deguelin；murine double mimute2；glycogen synthase kinase-3βCorrespondence to：JIANG Ke-hua，email：tjjkh@sina．comReceived：August26，2012；accepted：December27，2012磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路是细胞内重要的生存信号转导通路，细胞在多种因素刺激作用下，通过激活此信号通路，可诱导细胞增殖、分化，避免细胞发生凋亡，在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用［1］。

大量研究显示，PI3K/Akt信号通路对激素非依赖性前列腺癌的发生、发展起着重要作用。

阻断此通路可使前列腺癌细胞发生凋亡，抑制细胞增殖并延缓由激素依赖性前列腺癌向激素非依赖性的转变［2］。

本实验以Akt为作用靶点，在细胞水平上研究其抑制剂鱼藤素［3］对前列腺癌细胞的抑制效应及可能机制，为临床应用提供一定的理论依据。

1材料和方法1．1材料鱼藤素为瑞士Alexis公司产品，相对分子质量为394．4，化学分子式为C23H22O6，纯度为95．6%，用二甲亚砜（DMSO）溶解，配成20mmol/L的储存液，等量分装，－20ħ保存，使用前用DMEM 培养液稀释成所需浓度，将DMSO浓度控制在0．1%以下。

DMEM干粉培养基、优级小牛血清均购自Gibco公司，MTT、DMSO为Sigma公司产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，TR-Izol总RNA提取试剂购自Axygen公司，RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，兔抗人小鼠双微体2（murine double mimute2，MDM2）多克隆抗体、兔抗人糖元合成酶激酶3β（glycogen synthase ki-nase-3β，GSK3β）多克隆抗体均购自Bioworld公司，β-肌动蛋白单抗购自Santa Crua生物技术公司。

1．2细胞及细胞培养人前列腺癌PC-3细胞株购自武汉中国典型培养物保藏中心。

细胞用含10%小牛血清（100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）的DMEM培养液，于37ħ、5%CO2饱和湿度培养箱内常规培养。

1．3MTT法检测鱼藤素对PC-3细胞增殖的影响取对数生长期PC-3细胞，以5000个/孔接种于96孔培养板，细胞贴壁后加药，分为3组：调零孔（只含培养液DMEM，无细胞）、对照组（含0．1%DMSO 的DMEM培养液）、鱼藤素组（鱼藤素终浓度分别为10、100、500、1000nmol/L），每组均设3个复孔，置37ħ、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，分别培养24、48、72h后弃上清，然后加入MTT（200μg/ml，用无血清的DMEM培养液配置），继续培养4h后取出培养板，弃上清，每孔加150μl DMSO，振荡使结晶充分溶解，用全波长酶标仪测定波长570nm处的吸光度（A）值，实验重复3次，取其平均值。