影响体外受精效果的因素.

IVF的意义
1. 可利用屠宰场的卵巢生产大量价廉质优的胚 胎，可解决胚胎移植的胚胎来源问题。 2. 可使因生殖道疾病而无繁殖能力的优良母牛 仍能繁殖一定数量的后代。 3. 可结合活体采卵技术，充分发挥优良母牛的 繁殖潜力。 4. 可开发利用大量的腔前卵母细胞，进一步挖 掘良种母牛的繁殖潜力。
IVF的意义
受精滴中精子不同平衡时间
以加入精子时间为0h(对照组),分别在 0h,0.5h,1h,2h,4h随机加入等数卵母细胞 到各受精滴,结果显示:0h,0.5h组卵裂率 较高,分别为87.7%、84.7%,与其他组相 比差异显著(P<0.01);0.5h组的囊胚率最 高,为67.5%,与对照组的57.7%比较差异 显著(P<0.01)。结果表明,受精滴中精子 经过0.5h平衡后,弱精及死精粘聚沉淀,余 下活力强的健壮精子,此时加入牛卵母细 胞受精,可获得较高卵裂率及囊胚率。 (文国艺,阳年生;1999年月11月)
卵母细胞体外受精的评定
体外培养： 受精后48小时可检查其受精分裂率，体 外培养7天后检查囊胚发育率，培养9天 后，检查囊胚的孵化率。
卵子体外受精的影响因素
精子的来源 1. 取自附睾的精子比体外采集的精子容易在体 外诱发获能，故通常可获得较高的受精率。 2. 来自不同公畜的精液在活力、获能及顶体反 应的难易程度上均存在明显差异。 3. 不同公畜个体精子的受精分裂率有差异，但 其胚胎发育率的差异则更为明显。 4. 同一公畜个体在不同季节采集的精液，其体 外受精效果无明显差异。
体外受精技术
由卵母细胞成熟 精子获能 受精 受精卵体外培养 胚胎移植 程序组成的完整系统.
精子获能 capacitation
一般认为，雄性动物产生的精子必须在雌 性生殖道内停留一定的时间，发生一 定的生理变化后才能具备受精能力。此过 程称为精子获能。 精子的获能过程是 多时相，多步骤的复杂过程。
获能阶段
第一阶段： 获能的第一阶段是脱出精子 表 面 的 抗 பைடு நூலகம் 物 质 和 去 能 因 子 ，增强了膜通透 性。此过程在一定程度是可逆。
第二阶段： 是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反 应。此过程是不可逆的结构上的获能。 精子获能方法有 两 种：即体内获能和 体外获能。
休内获能
是从交配母畜的子宫内冲取精子用于受精。
受精液及其成分
受精液必须有利于精子的获能和卵子第二 次成熟分裂的完成。故通常为成分较为 简单的生理盐溶液。
最为常用受精液通常为TALP和BO，其渗透压一 般为285～295mosm，内含10mM的乳酸钠、 1mM的丙酮酸钠和2mM的Ca2+，其中Ca2+ 起关键作用。BO液中的NaHCO3浓度高达 35.7 mM，不含Hepes，主要用于用A23187 作为获能剂的受精液。TALP的NaHCO3浓度 通常为25～30 mM，内含5～10mM的Hepes， 主要用于用肝素作为获能剂的受精液。
体外获能
分两步： 一： 精子洗涤。离心以除去杂质，精清， 死精子，低活力的精子，冻精保护液及 稀释液。 二：获能处理，主要是使用离子强度液 （His)，钙离子载体，肝素（10— 100ug/ml, 15min)等。
精子体外获能的主要方法
1) 高渗溶液处理法：受精前用360mOm的高渗 溶液处理精子30分钟，然后进行受精。 2) 肝素处理法：用含100mg/ml肝素的受精液。 3) 用Ca2+载体A23187提高精子内部Ca2+的浓度。 4) 与血清白蛋白的溶液长时间孵育 5) 与含有卵泡液的培养液进行孵育
结果说明，在现行使用的、成分简单的 改良Tyrode’s受精液中，添加一定浓度 (25%~50%)含0.6%BSA的TCM199， 作为IVM后的牛卵母细胞体外受精液， 可以明显提高体外受精的质量，从而提 高胚胎的最终产量。 (谭世俭，卢克焕，1994年6月）
受精液中肝素和咖啡因的组合
采用2种肝素浓度(10，30mg/L)与3种咖啡因浓 度(2 .5，5，10mmol/L)的交叉组合，以30 mg/L肝素的受精液为对照，探讨肝素和咖啡 因对牛卵母细胞体外受精的影响，并确定受 精后将卵母细胞移至单层细胞的合适时间。 结果表明，当卵母细胞在受精后5h移至单层 细胞时，10mg/L肝素加5mmol/L咖啡因或 30mg/L肝素加2.5mmol/L咖啡因的体外受精 效果最好.(文国艺,卢克焕;1994)
受精用液种类的影响
应用改良Tyrode’s液(简称T，对照组)与 0.6%BSA-TCM199(简称BT)作为受精液〔实 验1)、这两种受精液的不同配比作为受精液 (T，BT分别为3:1、l:1和1:3，T为对照组， 实验2)和在不同受精时间采用不同受精液(先 用T，IVF 24h后改用BT或TCM199+10%发 情牛血清，实验3)，对经体外成熟培养后的 牛卵母IVF效果的影响。结果，应用成分复 杂的BT作为受精液，可以提高受精卵体外囊 胚发育率
5. 可使未成熟的牛犊繁殖后代，大大缩短育种 的世代间隔。 6. 可结合精子分离技术生产预知性别的胚胎， 达到了控制性别的目的。 7. 可为核移植和基因转移提供丰富的实验材料 和必要的辅助手段，加速其研究的进展。 8. 可作研究的手段，加深人们对卵母细胞发生 与成熟，精子的获能与受精以及胚胎的早期 发生等理论问题的认识.
影响体外受精效果的因素
历史与背景
• 1878年，德国科学家Schenk将体内成熟的家兔 和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观 察到第二极体排出和卵裂现象。 • 1944年，Pock和Menkin进行人卵的体外受精 实验。 • 1945年，美籍华人张明觉成功进行了兔的体外 受精实验。 • 1959年，美籍华人张明觉利用获能处理的家兔 精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批 体外受精的试管小兔。
体外受精的培养系统
目前通常采用的受精系统由微滴法和微孔板法。 1. 微滴法：液滴体积通常为30～50ml，上覆石 蜡油。该法的优点是受精效果好，精子利用 率高；缺点是需用石蜡油，比较麻烦。 2. 微孔板法：受精液体积通常为0.5～0.8ml， 上覆石蜡油或不加石蜡油。该法的优点是操 作简单，一次可受精大量的卵子；缺点是精 子的利用率相对较低，受精后的胚胎发育率 也不如微滴法好。