用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸

• 2.破碎细胞
• 菌体收集：取已经培养过夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心 管中，3000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。 • 细胞破碎：向离心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）缓冲液 （1:20），在漩涡混合器混合。然后再超声破碎仪下破碎， 功率和时间根据菌液多少确定。功率不得太高，不要起气 泡。循环次数不要太多，运行2s，间歇6s。冰上破碎效果 更佳，菌液破碎前为乳白色，破碎后为透明。 • 收集破碎液：将破碎好的液体倒入离心管中离心， 3000r/min离心5min。弃沉淀，上清液备用。
• L-酪氨酸对皮肤的作用
皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。 在人的表皮基层细胞间，分布着黑色素细胞，它含有的酪 氨酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间再经过一系列的代谢 过程，最后便可生成黑色素。黑色素生成得多，皮肤就越 黑；反之，则皮肤就越白皙。 研究证明，酪氨酸酶的活性 与体内的铜、铁、锌等元素密切相关。经常进食富含酪氨 酸和稀有元素锌、铜、铁的物质，例如动物内脏、肾，甲 壳类动物蛤、蟹、河螺、牡蛎，水产品乌鱼子，豆类的大 豆、扁豆、青豆、赤豆，硬壳果类花生、核桃、黑芝麻以 及葡萄干等，皮肤的色泽就较黑。因此住在海边的人，打 渔的渔民，由于吃以上水产品较多，因此皮肤色泽较黑。
弗氏柠檬酸菌的培养及破碎
弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸 杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧， 为条件致病菌，广泛分布于自然界中，是人和动物(哺乳 类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。 药物敏感性试验结果表明，该菌对氟罗沙星、头孢曲松、 环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星 等7种抗生素高度敏感。
L-酪氨酸的酶法合成
• L-酪氨酸是目前仍采用水解法生产的少数氨基酸之一，应 用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研 究热点之一。 • 酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase），也称β-酪氨酸 酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨， 但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必须氨基酸、 对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。
参考文献
[1]杨金奎,何璧梅.微生物方法生产L-半胱氨酸的研究进展[J].国外医 药(抗生素分册).2001(04); [2]薛文华.电化学法制备L-半胱氨酸的研究[J].广州化工.2012(13); [3]吴玉芹;陈金龙.水溶性蓝光发射金量子点灵敏检测L-半胱氨酸[J]. 应用化学.2013(02); [4]朱婉华.L-半胱氨酸盐酸盐的电化学合成法及其应用[J].南京大学 学报(自然科学版).1986(03); [5]周昌平;怀丽华;白钢;杨文博;陈宁.酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨 酸的酶促反应条件研究[J].生物技术通讯.2006(06); [6]周新月.蚝油酶法生产工艺的研究[J].食品工业科技.1994(04); [7]马少敏;韦航;蒙健宗.酶法生产海藻糖的定量分析方法[J].大众科 技.2008(10); [8]张晓驷,冯静波.功能性蛋白短肽的蛋白酶法生产研究[J].中国饲 料.2004(19).
• 实训操作：
• 1.检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干 燥箱内120℃烘干。 • 2.规划：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的 下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A， 在直线上做4个记号，记号之间隔2cm，这就是原点的位置。 另在距左边缘1cm处划一条平行于左边缘的直线B，在B线 以上A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）。
• 特征特性：革兰阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞， 无荚膜。具有氨苄青霉素（Ampr）、卡那霉素（Kanr）、 四环素（Tcr）及链霉素（Strr）抗性。光滑、低凸、温润、 半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐。菌体杆状， 直径1.0，长2—6μm。菌落直径2—4mm。出芽繁殖为主， 酒类增香。用于白酒增香。可以含有10ppm MG的无机盐 培养基中正常生长，最适生长温度为30℃。
实验操作
实验材料：
菌株：弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii)
试剂：
LB培养基： 配方：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 15~20g 、水 1000mL（调节pH 7.4~7.6）
• 1.菌种培养：
• 配制培养基 • 菌种活化 • 待灭菌后的固体培养基冷却至50℃时，倒入平板中（大约 每平板15mL），待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。 接种好的平板倒置于培养箱中，37℃培养24h。 • 扩大培养：挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体 培养基的三角瓶中进行扩大培养。37℃、200r/min摇床过 夜培养。（培养时间不能太长• 福林酚试剂时磷铂酸与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件 下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的 混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林酚 试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
• 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸
• L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一， 收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨 酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的 工艺是丙酮酸路线。
• 3.点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合 样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的 氨基酸圈内，待晾干或冷风吹干后再点第二次。前三种氨 基酸各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成 筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝 隙。 • 注意：点样用的毛细管和试剂瓶上的氨基酸是一一对应的， 千万不能混淆，以免污染。
• 酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热 菌和节肢动物体重，其中酶活较高的微生物主要是草生欧 文氏菌、中间柠檬酸菌、弗氏柠檬酸以及嗜热菌和Symbiobacterium toebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL， 其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应 用方面取得重要进展。
• 制备或来源：
1.由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中 提取； 2.以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌 发酵而得； 3.以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。 用途： 1.医药用作甲状腺功能亢进； 2.食品添加剂。 3.是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、 L-多巴等药物的主要原料。 4.广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆 虫饲料。
酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定
• 实训原理： • 纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动 相时而得到分离的方法。
• 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和 力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维 和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤 纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之 间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关， 因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。
• 实训器材及试剂：
• 层析缸、毛细管：5只/组、培养皿：1只/组、层析滤纸 （长16cm、宽16cm的）：1张/组、直尺、铅笔、电吹风、 针、白线、小试管：4只/组、移液管、喷雾器。
• 1.展层剂和平衡液： • 正丁醇：冰醋酸：水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上 层做展层剂；下层液（弃去）。 • 2.样品液： • 用水配成酶1mL含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各mg/mL的 氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液（各4mg/mL） • 3.茚三酮： • 按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。
项目四 用弗氏柠檬酸菌酶法
合成L-酪氨酸
目录
• • • • • L-酪氨酸 L-酪氨酸的酶法合成 弗氏柠檬酸菌的培养及破碎 酪氨酸裂解酶的活力测定 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸
L-酪氨酸
• L-酪氨酸属氨基酸的一种，结晶性粉末，无味，易溶于甲 酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸胡哦哦稀硝 酸中溶解。从酪蛋白或玉米等含蛋白质物质的水解液中提 取，是人体非必需氨基酸。医药上用作治疗甲状腺功能亢 进，也可做为食品添加剂。 • 中文名称:L-酪氨酸 中文别名:L-β-对羟苯基-β-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯 基丙酸 英文名称:L-Tyrosine 分子式:C9H11NO3 分子量:181.19
• 4.层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅放置于层析缸 中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置， 切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前言到达滤纸2/3处， 取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。
• 注意：点样端朝下，点样处不能没入层析液中，滤纸不能 贴壁。 • 显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。
• Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化 细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、 45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转 化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置 于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%， 且稳定性可维持5d。