结核病耐药性快速检测新技术及其应用评价
耐药结核病诊断新技术解析共42页
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
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6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核分枝杆菌耐药性不同检测方法的比较与评价
结核分枝杆菌耐药性不同检测方法的比较与评价目的：探讨两种方法在结核分枝杆菌耐药性快速检测的应用可行性。
方法：应用直接法与传统法进行耐药试验，比较两者的耐药结果。
结果：与传统法耐药管培养结果比较，涂片≤2+的痰标本的低浓度耐药试验直接法的结果RFP、INH、EMB耐药性符合率分别为28.6%、50.0%、12.5%，耐药性总符合率为30.4%，两者差异有统计学意义。
结论：直接法应用于结核分枝杆菌耐药试验是可行的，对临床上肺结核病人耐药性的快速检测具有一定价值。
标签：结核分枝杆菌；肺结核；直接耐药试验；耐药性检测结核分枝杆菌高耐药是结核病病情恶化的重要原因，已成为当前结核病临床和防治工作的难题。
常规药敏试验方法，如用罗氏培养基等做直接或间接药敏试验，由于受MTB生长缓慢的影响而费力、费时(需6～8周或更长时间)，不能满足临床需要，目前已较少使用。
故目前急需一种简单、快速、价廉、灵敏、特异的检查方法。
为了指导临床用药，本文实际比较了结核分枝杆菌耐药性不同检测方法的效果，现报道如下：1材料与方法1.1材料结核分枝杆菌共35株(份)，均自我院住院和门诊患者的痰、胸腔积液、腹腔积液等标本中分离，经对硝基苯甲酸(PNB)噻吩，2-羧酸肼(TCH)鉴别培养基培养鉴定为结核分枝杆菌。
痰标本处理按规定要求进行痰标本处理[1]。
1.2检测方法直接法：取经前处理的标本液0.1 ml，均匀接种于各培养基斜面上，每份标本按每个药物浓度管2支，不含药物的对照管2支、分离培养管2支进行接种。
接种后放37℃孵箱培养，2周内每天观察1次，2周后每周观察1次，药敏试验管至4周报告药敏结果。
传统法：取上述直接法分离培养基上生长的菌落，采用传统法进行药敏试验。
按传统规定药敏试验结果观察报告结果。
1.3耐药判定标准以含药培养基无菌落生长者报告敏感(S)，有菌落生长≥20个者报告耐药(R)。
2结果2.1痰涂片结果直接法培养的对照管有菌落生长的共34例，占97.1%，其中结果报告3+以上的有25例，2+及以下的有8例，阴性的1例。
结核分枝杆菌耐药性检测
二、常用的MTB DST检测方法
（二）探针熔解曲线法
采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、Sm、EMB和FQs 常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室 污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整 个检测过程只需2～3 h，可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断 MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射类药物耐药）；其 缺点是不报告具体的突变类型。
二、常用的MTB DST检测方法
分子DST方法
该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检 测MTB的耐药基因型。分子DST已成为DR-TB的确诊方法之一，其建立 在基因扩增基础上，快速（2～48 h）、敏感地从MTB分离株或预处理的 临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子 DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提 取后标本的传染风险降低。
绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了 该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导 致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。
二、常用的MTB DST检测方法
（一）传统的DST方法
1.绝对浓度法（absolute concentration method）：将1 mg/ml菌悬液用生理 盐水倍比稀释至10^-2 mg/ml，吸取0.1 ml菌液分别接种于含高、低浓度药 液培养基和对照培养基上，置37 ℃培养4周，按下列方式报告菌落生长情 况：分枝杆菌培养阴性（－）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性 （+）：菌落生长占斜面面积的1/4；分枝杆菌培养阳性（++）：菌落生 长占斜面面积的1/2；分枝杆菌培养阳性（+++）：菌落生长占斜面面积 的3/4；分枝杆菌培养阳性（++++）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜 面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析快速准确地诊断出结核分枝杆菌感染是控制和治疗结核病的前提和关键。
多年来，结核杆菌的诊断技术在不断地发展和创新，近年来，一些针对结核杆菌检测的新方法陆续被报道，一些新型的诊断技术产品也陆续上市。
本资料综述了结核杆菌的主要诊断方法，并对目前国际市场上广泛应用的商业化诊断技术产品进行了简要分析。
标签：结核分枝杆菌；诊断技术；分析Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical applicationFENG?Meimei1??SU?Wenqin21.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China[Abstract] Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.[Key words] Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核最多见。
结核杆菌及其耐药性快速检测
结核杆菌及其耐药性快速检测一、结核杆菌及其检测方法介绍结核分枝杆菌，又被称作结核杆菌，它是引发结核病的病原细菌。
主要通过呼吸系统结核患者传播，能够侵犯全身各个器官，最常见的为肺结核。
根据世界卫生组织的估算，全球每年增加的结核病人大约在800万左右，死于结核病的人大约在300万左右，全世界人口的三分之一，也就是大约17亿人曾经感染过结核杆菌。
在发展中国家，目前结核病的发病概率依然在持续地上升，在发达国家的病人也是有所上升的，比较常见于高危人群中（比如慢性酒精中毒的人、感染过HIV的病人、滥用药物的人以及无家可归的人）。
在控制结核的过程中，建立敏感、快速、特异的检测结核杆菌的手段具有非常重大的现实意义。
直到目前为止，结核的诊断依然主要依靠透视检查、临床症状、痰标本镜下检查、结核菌素试验或者痰标本结核杆菌培养等。
通过临床症状以及透视检查不能够发现早期的结核病人，并且特异性不是很强；结核菌素试验的特异性不是很强，阳性也只能说明在以前有否暴露在分枝杆菌下；痰标本镜检的敏感性和特异性也不能达到要求；培养的方法来分离结核杆菌是判断结核的重要标准，但是常规的培养方法需要的时间比较长，一般需要几个周的时间。
近年来，结核杆菌（包括牛型、人型、非洲型）在快速检测方面取得了快速的发展，主要包括基因扩增技术和改良液体培养方法。
建立准确、快速的耐药性检测方法，能够有效指导并制定科学合理的治疗方式，及时判断治疗是否成功，并且是否产生了耐药性，也有利于展开大规模的结核杆菌的耐药性调查。
之前基于培养方法来检测结核杆菌的耐药性，耗时比较长，并且结果不一定准确，这些年来，耐药性的快速检测方法已经取得了较大的进展，大体包括：噬菌体检测方法、改良液体培养方法以及基因检测方法等。
二、结核杆菌的快速检测方法（一）改良液体培养方法这些年来，已经建立了多种多样的改良液体培养方法，大大缩短了培养所需要的时间，这类的试剂盒包括了Bactec 9000MB、Bactec 460TB以及MGIT等。
结核病实验室检测新诊断技术
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间
生物安全级别要求 人员培训
操作简易程度 仪器设备
HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高
常规药敏方法 2-3个月
二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高，易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。
，
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通 过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。
结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 （利福平、异烟肼）。
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 • 对数目少的不必使用镜油 • 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂
片 • 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加
适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法
流程图
痰标本消化灭活 基片的夹层杯
离心 细菌附着在基片
在夹层杯中
直接染色 取出基片
于载玻片上
镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯 （专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。
结核病诊断和耐药性检测新技术
分 支 杆 菌 复 合群 和其 他 Ｎ ＴＭ 。该 方 法 只 用 于 活 的 Ｍ．ｂ的鉴 ｔ
定 。Ｃ ｐｌ Ｂ 检 测 Ｍ．ｂ的敏 感 性 与 特 异 性 分 别 为 ９ ． ％ ａ ｉａＴ ｉ ｔ ９２ 与 ９ ． ［ 。结 果 报 告 时 问 仅 需 １ ｎ ７９ ４ ３ ｍｉ。测 序 分 析 发 现 ， ５ ＭＰ ６ Ｂ ４的 突 变 率 为 ３ １ ， 致 ＭＰ ６ ． 导 Ｂ ４的 ｃ 末 端 缺 失 。所 以 ， 有 Ｍ．ｂＭＰ ６ 所 ｔ Ｂ ４突 变 流 行 的 地 区 使 用 该 方 法 前 要 进 行
ｅ 学 的有 限公 司 （ 京 、 ｎ化 东 日本 ） 发 。该 平 台 不 是 特 定 用 于 研 结 核 病 检 测 ， 已经 用 于检 测 其 他 的 微 生 物 。它 的 主要 优 点 是 现
快速 、 不需 要 热 循 环 控 制 装 置 ， 于高 流通 量 ， 便 增加 了操 作 的 可
行 性 。技 术 运 用 ４个 不 同 的 引 物 特 定 的 用 来 识 别 靶 基 因 上 ６
条 试 验 ， 利 用 Ｐ Ｒ 和反 向 杂 交 方 法 快 速 地 检 测 耐 药 性 相 关 其 Ｃ
突变 。商 品化 线 型 探 针 试 验 包 括 Ｉ ＮＮＯ ＩＰ Ｒ 来自ＴＢ试 剂 盒 － ｉＡ． ｉ ．
探讨XpertMTB_RIF结核分枝杆菌复合群快速分子鉴定及利福平耐药性检测应用价值
探讨Xpert MTB/RIF结核分枝杆菌复合群快速分子鉴定及利福平耐药性检测应用价值发布时间：2023-03-10T01:12:42.652Z 来源：《中国医学人文》2022年12月12期作者：刘清华王代华古贞成希[导读]探讨Xpert MTB/RIF结核分枝杆菌复合群快速分子鉴定及利福平耐药性检测应用价值刘清华王代华古贞成希（遂宁市安居区人民医院；四川遂宁629000）摘要：目的本文评估Xpert MTB/RIF技术测定结核分枝杆菌和利福平耐药性的价值。
方法挑选2020年1月-2020年7月在我院治疗的肺结核患者与非结核患者作为此次研究对象，其中肺结核患者178例，非结核患者45例，全体患者痰标本分别使用Xpert MTB/RIF与痰涂片检查结核分枝杆菌单独检测，及同时检测MTB与利福平耐药性。
评估检测结果。
结果以临床诊断为作为参考，Xpert MTB/RIF 阳性率为52.80%，痰涂片分枝杆菌检测为37.60%。
以痰涂片结果作为参考，Xpert MTB/RIF 检测 MTB的敏感度为65.67%，特异度为 54.95%。
2种方法检测 MTB 吻合率为 58.99%，利福平耐药率为8.51%。
结论 Xpert MTB/RIF 检测技术操作流程简便，有较高的灵敏度与特异度，应用价值高。
关键词： Xpert检测；结核分枝杆菌；利福平；耐药Abstract: Objective To evaluates the value of Xpert MTB/RIF technology in determining the resistance of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin.Methods Tuberculosis patients and non-tuberculosis patients treated in our hospital from January 2020 to July 2020 were selected as the subjects of this study, including 178 tuberculosis patients and 45 non-tuberculosis patients, and all patients used Xpert MTB/RIF and sputum smear to check mycobacterium tuberculosis separately, and simultaneously detected MTB and rifampicin resistance. Evaluate test results.Results Taking the clinical diagnosis as a reference, the positive rate of Xpert MTB/RIF was 52.80%, and the detection rate of Mycobacterium sputum smear was 37.60%. Using sputum smear results as a reference, xpert MTB/RIF detected MTB with a sensitivity of 65.67% and a specificity of 54.95%. The two methods detected MTB anastomosis rate of 58.99% and rifampicin resistance rate of 8.51%. Conclusion Xpert MTB/RIF detection technology is easy to operate, has high sensitivity and specificity, and has high application value.Keywords: Xpert detection; Mycobacterium tuberculosis; rifampicin; drug resistance结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起并严重威胁人类健康的主要传染病。
结核病的分子生物学检测与药物疗效评估
结核病的分子生物学检测与药物疗效评估简介：结核病是一种严重威胁人类健康的传染病，由结核杆菌引起。
传统的结核病诊断方法主要依靠临床表现、X射线检查及培养，但这些方法存在一定的限制。
近年来，随着分子生物学技术的发展，结核病的分子生物学检测方法得到了广泛应用，并为药物疗效评估提供了新思路。
一、分子生物学检测在结核病诊断中的应用1. PCR技术在结核菌检测中的应用PCR（聚合酶链反应）是一种敏感且特异性强的分子生物学技术，能够快速而准确地检测出结核杆菌DNA。
通过PCR检测可以迅速确定结核病阳性患者和阴性患者，并能够对耐药性进行分析。
2. 基于RNA的新型分子生物学诊断方法除了基于DNA的PCR技术外，近年来还出现了基于RNA的新型诊断方法，如reversed transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)技术。
这种方法不仅具有高度敏感性和特异性，而且能够在室温下进行反应，对于结核病的早期诊断具有很大的潜力。
3. 拮抗试验在结核杆菌检测中的作用拮抗试验是一种通过寻找对某种药物抵抗的细菌株来间接检测细菌存在的方法。
利用这种技术，可以判断出患者体内是否存在耐药性结核杆菌，并能够指导合理选择药物治疗方案。
二、分子生物学评估结核病药物疗效1. 耐药基因检测预测耐药性分子生物学技术可以通过检测结核杆菌中与耐药相关的基因突变来预测患者对某些药物的耐药性。
例如，当发现某个特定基因突变时，就可以判断该患者对某种抗结核药物是否产生耐药性。
2. 荧光素酶活力测定评估抗结核活性分子生物学技术还可以通过测定抑制剂诱导基因表达（LUC）活性来评估患者体内抗结核药物的活性。
这种方法能够提供更加客观和准确的药物疗效评估，从而指导治疗方案的选择。
3. 分子生物学技术在药代动力学研究中的应用药代动力学是研究药物在机体内吸收、分布、代谢和排泄过程的学科。
利用分子生物学技术可以对药物代谢酶作用、激素受体表达以及受体配基互作进行定量测定，评估特定药物在个体水平上的疗效和副作用。
结核分枝杆菌耐药性的研究
结核分枝杆菌耐药性的研究结核病是一种由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 引起的慢性传染病。
该病在全球范围内广泛存在，尤其在发展中国家中尤为常见。
然而，随着时间的推移，病原体逐渐进化并发生耐药性。
毒菌学家们最近对结核分枝杆菌的耐药性进行了研究，以了解这种病原体的新的抗药性机制。
结核分枝杆菌的耐药性结核分枝杆菌是一种革兰阳性的细菌，存在于气溶胶中，并通过呼吸道被人体吸入。
这种细菌可以耐受抗结核药物，使得病人复发或出现难治的病例。
结核分枝杆菌的耐药性主要分为以下几种类型：1.单药耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物产生耐药性。
2.多药耐药：结核分枝杆菌对异烟肼和利福平两种药物产生耐药性。
3.极耐药性：结核分枝杆菌对异烟肼、利福平和其中至少一种次级药物产生耐药性。
该病原体的耐药行为是由许多基因突变引起的。
耐药突变可以降低药物与细菌的相互作用，导致药渗透减少或抗菌药物代谢增加等现象。
因此，治疗复杂、费用高昂，对全球公共卫生构成威胁。
结核分枝杆菌的基因组学研究随着基因组学技术的迅速发展，科学家们能够更好地理解结核分枝杆菌获得耐药性的基因机制。
研究现有的截至2010年的稳定基因组序列后，毒菌学家们发现结核分枝杆菌的比较基因组学和基因功能分析有助于了解该菌的新的耐药性机制。
一个主要的发现是，在结核分枝杆菌的基因组中，有一个名为WhiB7的调节因子，它可以在细胞内激活多个下游基因，从而促进细菌对异烟肼的耐药性。
此外，已经证明，哺乳动物宿主中具有抗击结核分枝杆菌的免疫路径（包括干扰素致死和内体消化等）。
结核分枝杆菌的药物治疗研究药物治疗是治疗结核病的主要方法。
第一线药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等。
但是，由于其慢生长率，结核分枝杆菌需要治疗长达6到9个月，而治疗代价昂贵，并且表现出不可预测的耐药性问题。
一些研究表明，与传统药物相比，新开发的抗结核药物更具潜力。
这些药物包括间位卡那霉素（一种耳鼻喉科常用药物）、利福霉素和赛拉奥星等。
HAIN技术快速检测耐药结核病及耐多药结核病效果评价
进 行 耐药 基 因检 测 及 对 检 测 结 果 进 行 判 读 。以 药 敏 法 结果 为 金标 准 ， 计算 ＨＡＩ Ｎ 技 术 检测 菌株 耐 药性 的 的特异 性 、 敏感 性和符 合 率 。
１ ． ３ 统 计 分 析 采 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ８ ． ０进 行 数 据 统 计 ， 率 的 比较 采用 。 检验 ， Ｐ％０ ． ０ ５为差 异有 统计 学意 义 。
关键词 ： 结核分枝杆菌 ； 耐药结核病 ； 耐多药结核病 ； ＨＡＩ Ｎ技术 ； 快速检测 ； 利福平 ； 异 烟 肼
中图 分 类 号 ： Ｒ ５ ２ 文献标识码 ： Ｂ 文章编号 ： １ ０ ０ ６ —９ ０ ７ ０ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ｌ 一０ １ ０ ３ —０ ２
我 国是 耐 药结 核病 高 负 担 国家 之一 ， 据 ＷＨＯ 估
２ 结 果
药分 析 ， 以评估 ＨＡＩ Ｎ 检测 方法 诊 断耐 药结 核病 尤 其
是 ＭＤＲ — Ｔ Ｂ的临床 应用价 值 。
Hale Waihona Puke １ 材 料 与 方 法 ２ ． １ 两种 方 法检 测 结 果 以 药 敏 法 、 ＨＡＩ Ｎ 技 术 检
１ ． １ 菌株
随机 抽 取 ２ ０ １ ５年 泰 州 市 所辖 的各 市 、 区
毒 株 耐 药 率 和耐 多药 率结 果 差 异 均 无 统 计 学 意 义 （ Ｐ值均 ＞０ ． ０ ５ ） 。 ＨＡＩ Ｎ 技 术 检 测 菌 株 对 利 福 平 耐 药 性 的敏 感 性 、 特 异 性 和符合率分别 为 ９ ６ ． ３ Ｏ 、 ９ ９ ． ２ Ｏ 和 ９ ９ ． ３ ３ ； 对 异 烟肼 耐 药性 的 敏感 性 、 特 异 性 和 符 合率 分别 为 ９ ７ ． ４ ７ ％、 ９ ９ ． Ｏ ９ 和 ９ ９ ． ３ ３ ； 对 ＭＤＲ — Ｔ Ｂ耐 药 性 的 敏 感 性 、 特 异 性 和符 合 率 分 别 为 ９ ２ ． ８ ６ 、 ９ ９ ． ２ ７ 和 ９ ９ ． ３ ３ 。ＨＡＩ Ｎ技 术 检 测 时 间 一 般 为 ≤ ６ ｈ ， 药敏法为 ４ ～６ Ｗ。 结 论 ＨＡＩ Ｎ 技 术 能 够快 速检 测 耐 药 、 耐多药结核病 ， 可 在 有 条 件 的实 验 室 进 行 推 广 。
线性探针技术检测肺结核患者耐药情况临床评价
特异度分别为 ９０．８６％和 ８７．２４％。结论 ＨＡＩＮ技术能用于快速、准确地诊断利福平和异烟肼的耐药性，可作为辅助检测手段用于临床 结核病尤其是耐药结核病的诊治。
关键词：线性探针；利福平；异烟肼；耐药性检测；实验诊断
中图分类号：Ｒ４４６；Ｒ５２１
文献标识码：Ａ
文章编号：１００６－４９３１牗２０１９牘０２－００２３－０４
侯 婧，韩 ，张 艳，孟 婧
（安徽省胸科医院，安徽 合肥 ２３００２２）
摘要：目的 评价线性探针（ＨＡＩＮ）技术用于临床抗结核治疗的价值。方法 收集 ２５１例痰抗酸杆菌涂片阳性肺结核患者的痰标本， 以 罗 氏培 养 及药 敏 试 验为 “金 标准 ”，采用 ＨＡＩＮ技 术检 测 异烟 肼 及 利福 平 的耐 药 情况 。结 果 ＨＡＩＮ技术 对 男 性 涂阳 患 者 利 福平 （χ２ ＝０．６３４，Ｐ＝０．４２６）和 异 烟 肼 （χ２ ＝０．９５１，Ｐ＝０．３２９）的 耐 药 检 测 ，对 女 性 涂 阳 患 者 利 福 平 （χ２ ＝０．１７４，Ｐ＝０．６７６）和 异 烟 肼 （χ２＝２．７９１，Ｐ＝０．０９５）的耐药检测，以及全部涂阳患者利福平（χ２＝０．８０６，Ｐ＝０．３６９）和异烟肼（χ２＝０．０１２，Ｐ＝０．９１４）的耐药性检测 效果与“金标准”比较，差异均无统计学意义 牗Ｐ＞０．０５牘。ＨＡＩＮ技术对利福平和异烟肼耐药检测的灵敏度分别为 ８７．６９％和 ５７．７３％，
综上所述，三七总皂苷对心肌缺血模型大鼠的血清 生化学和血液流变学指标有一定改善作用，其机制可能 与抗氧化和改善血液质量有关。
犤８犦姬艳苏，冯利民 ．三七总皂苷对心肌缺血大鼠血清 ＩＬ－６和 ＡｎｇⅡ的影响 犤Ｊ犦．江苏中医药，２０１４，４６（４）：７２－７３．
２０１３，４８（１１）：８９９－９０３． 犤４犦秦旭航，孙敬蒙，郑 菲，等 ．三七总皂苷类脂质体抗急性心
耐药结核快速诊断方法评价及治疗效果分析
耐药结核快速诊断方法评价及治疗效果分析发表时间：2018-03-20T13:27:52.270Z 来源：《医药前沿》2017年12月第36期作者：刘淑红[导读] 研究耐药结核快速诊断方法及治疗效果。
（威海市结核病防治所山东威海 264200）【摘要】目的：研究耐药结核快速诊断方法及治疗效果。
方法：选取94例耐多药结核病和广泛耐药结核病患者，留取痰液样本对结核分枝杆菌耐药性进行噬菌体裂解法和比例法检测，同时给予患者相应的治疗，对噬菌体裂解法的诊断准确性及疗效进行评价。
结果：噬菌体裂解法检测利福平耐药性的符合率为96.80%；检测异烟肼耐药性的符合率为94.68%；检测链霉素耐药性的符合率为95.74%；检测乙胺丁醇耐药性的符合率分别为93.62%；患者治疗2年后复查痰涂片及痰培养的阴转率均有下降，且差异均显著(P<0.05)。
结论：噬菌体裂解法对于痰样本中结核分枝杆菌对4种药物耐药性的检测准确性较高，简单快速，耐结核患者的疗效及成功率均有所提升。
【关键词】耐药结核；快速诊断；治疗效果；分析【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）36-0087-01 结核分枝杆菌(MTB)是使人体发生结核病的感染病菌，该疾病的发病率及死亡率均处于较高的水平。
MTB 种群由于发生随机染色体突变，从而使其在遗传上具有了抗结核药物的耐药性；另外，由于受到抗结核药物的筛选压力，使其的突变株生长数目高于敏感株[1]。
现今，耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的发病率升高，使得人们对结核病快速诊断备受关注。
MTB由于生长较为缓慢，使得检测结果不能在短时间内获取，大大增加了该病菌的传播。
因此，建立一种快速、高效的检测方法对于MTB耐药菌株的确认具有重要的意义。
1.资料与方法1.1 一般资料自2014年4月—2016年10月的94例MDR-TB和XDR-TB患者，其中MDR-TB患者52例，XDR-TB患者42例。
结核分枝杆菌耐药性检测新进展
㊃综 述㊃D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2015.08.012作者单位:300350天津市海河医院 天津市呼吸疾病研究所国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室通信作者:吴琦,E m a i l :w q572004@163.c o m 结核分枝杆菌耐药性检测新进展梅早仙 韩骏锋 吴琦ʌ摘要ɔ 结核分枝杆菌(M T B )的耐药形势日趋严重,耐药结核病的及时诊断对患者的治疗结局及结核病的控制十分重要㊂M T B 传统的培养及药敏结果回报需时2~3个月,M T B 耐药性的快速准确诊断是一个急需解决的问题㊂本文总结了M T B 耐药性检测的传统技术包括罗氏培养及快速培养,并对比分析了其优缺点㊂综合国内外文献阐述了显微镜观察药物敏感性测定法的研究进展及分子生物学快速诊断技术包括线性探针杂交技术㊁X pe r tM T B /R I F 检测技术㊁基因芯片诊断技术及滚环扩增技术对于M T B 及其耐药性检测的最新动态㊁各种检测方法的适用范围,并对比分析了各种检测方法的优缺点,为临床医师选择快速准确的诊断工具提供最佳的选择㊂ʌ关键词ɔ 结核分枝杆菌;药物敏感试验;耐药结核病;快速诊断R e c e n t a d v a n c e s i n l a b o r a t o r y d e t e c t i o no fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s a n dd r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g M e i Z a o x i a n ,H a nJ u n f e n g ,W u Q i .T i a n j i n H a i h e H o s p i t a l ,T i a n j i nI n s t i t u t eo f R e s p i r a t o r y D i s e a s e s ,T r a d i t i o n a lC h i n e s e M e d i c i n e K e y R e s e a r c h L a b o r a t o r yf o rI n fe c t i o u s D i s e a s e P r e v e n t i o nf o r S t a t e A d m i n i s t r a t i o no f T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e ,T i a n j i n 300350,C h i n a C o r r e s p o n d i ng a u th o r :W uQi ,E m a i l :w q572004@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s (M T B )d r u g -r e s i s t a n c e i sb e c o m i n g i n c r e a s i n g l y s e r i o u s ,t i m e l y d i a g n o s i so fd r u g -r e s i s t a n tt u b e r c u l o s i si si m p o r t a n tf o rc o n t r o lo ft u b e r c u l o s i sa n dt r e a t m e n t o u t c o m e .M T Bt r a d i t i o n a l c u l t u r ea n dd r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g r e s u l t sn e e d2-3m o n t h s .R a pi da n d a c c u r a t ed i a g n o s i s o fM T Bd r u g -r e s i s t a n c e i s a u r g e n t p r o b l e mt ob e s o l v e d .T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h eM T B r e s i s t a n c et e s t i n g o fc o n v e n t i o n a lt e c h n i q u e s ,i n c l u d i n g R o c h ec u l t u r ea n d r a p i d c u l t u r e ,c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e a d v a n t a g e s a n dd i s a d v a n t a g e s .C o m p r e h e n s i v e l i t e r a t u r ed e s c r i b e s a d v a n c e s i n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o no f d r u g s u s c e p t i b i l i t y m e t h o d o l o g y a n dl a t e s td e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g y t e c h n i qu e s ,i n c l u d i n g l i n e p r o b e a s s a y ,X p e r tM T B /R I F t e s t i n g t e c h n o l o g y ,g e n e c h i p d i a g n o s t i c t e c h n o l o g y a n d r o l l i n g c i r c l e a m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y f o r M T B a n dd r u g r e s i s t a n c ed e t e c t i o n ,t h es c o p eo fv a r i o u sd e t e c t i o n m e t h o d s .A n dc o m p a r a t i v ea n a l y s i so ft h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a ge so fv a r i o u sd e t e c t i o n m e t h o d s p r o v i d e s t h eb e s t c h o i c ef o r c l i n i c i a n s i n t h e s e l e c t i ng e f f e c t i v e a n da c c u r a t e d i a g n o s t i c t o o l .ʌK e y w o r d s ɔ M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ;D r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g ;D r u g -r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s ;R a p i dd i a gn o s i s 结核分枝杆菌(M T B )的耐药形势日趋严重,耐药肺结核尤其是耐多药肺结核(M D R -T B )和广泛耐药肺结核(X D R -T B )的流行与传播引起世界各国学者的极大关注[1]㊂据2000年与2010年的第四㊁五次流调显示我国的结核病疫情不容乐观,具有高感染率㊁高耐药率及低结核病发现率等特点[2]㊂第五次结核病流调显示我国一线抗结核药品的耐药率为36.8%,二线抗结核药品的耐药率为24.6%[3]㊂我国是WHO 认定的27个M D R /X D R -T B 高负担国家之一㊂M T B 传统的药敏检测是依靠培养进行,结果回报需1~3个月,易造成延误诊治及耐药结核病的传播㊂线性探针杂交和X pe r tM T B /R I F 已被WHO 推荐应用于耐药结核病的快速检测[4]㊂随着对M T B 生长特征的认识及基因组学的发展,近年来对M T B 的耐药性检测的研究取得了较大进展,本文就M T B 耐药性检测技术作一综述㊂1 M T B 耐药的表型检测方法该方法主要是在M T B 培养的基础上利用其生长或生化特性来进行耐药检测㊂临床上常用的液体培养及固体培养的药敏检测是金标准,其他耐药性的表型检测方法还包括显微镜观察药物敏感性测定法㊁噬菌体法药敏检测技术㊂1.1 传统的固体及液体培养方法检测药敏试验 罗氏培养具有敏感和可得到纯培养物的优点,目前在罗氏培养基上可通过硝酸还原酶测定法㊁烟酸测定法㊁孔雀石绿微管药敏检㊃116㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第8期 I n t JR e s p i r ,A pr i l 2015,V o l .35,N o .8测法(m a l a c h i t e g r e e n m i c r o t u b e s u s c e p t i b i l i t y a s s a y, MGM T)进行M T B的药物敏感性检测㊂硝酸盐还原实验是最常用的方法之一,可用于痰㊁体液等标本多种一线及二线不同浓度抗结核药的耐药性检测[5]㊂但是其特异性较低㊁需时长㊁操作相对复杂尤其生物安全难以控制是限制其临床应用的缺憾㊂烟酸又称尼克酰胺,是吡嗪酰胺的类似物㊂通过在罗氏培养基上可用烟酸测定法检测M T B对吡嗪酰胺的体外敏感性㊂M a r t i n等[6]通过在L J培养基上使用不同浓度尼克酰胺检测了M T B对吡嗪酰胺的耐药性,参照液体培养检测结果将500m g/L的尼克酰胺的浓度界定为临界点㊂MGM T可分为直接MGM T和间接MGM T㊂MGM T技术简单快速且不需要昂贵设备,适合于基层医院开展应用㊂目前临床上使用的液体培养系统主要有B A C T E C T M MG I T T M960系统㊁B a c t/A L E R T3D㊁E S PⅡ等㊂B A C T E C T M MG I T T M960系统较常用,在B A C T E C T M MG I T T M960系统可应用氧化还原指示法㊁荧光素酶测定法检测M T B的药敏试验㊂荧光素酶测定法属于噬菌体检测药敏试验㊂氧化还原指示法的原理是M T B在生长过程中产生的代谢产物可与氧化还原剂发生反应,其中氧化还原剂在发生氧化还原反应时颜色会发生变化,根据颜色的变化来判断M T B的生长情况,从而判断M T B对某种药物是否耐药,常用氧化还原指示剂为A l a m a rB l u e(又称刃天青)和噻唑蓝㊂分枝杆菌的快速培养系统可缩短检测时间,除了可行一线抗结核药物的药敏检测外,最近的研究报道了快速培养系统能行多种氟喹诺酮的耐药检测,I s a e v a等[7]以M T B菌株g y r A㊁g y r B基因检测为基准,用比例法在B A C T E C T M MG I T T M960系统确定了M T B对莫西沙星及加替沙星耐药的临界浓度为0.25m g/L,用绝对浓度法以L o w e n s t e i n-J e n s e n为介质,M T B对莫西沙星及加替沙星耐药的临界浓度为0.75m g/L㊂但是液体培养基检测M T B药物敏感性仍需4~6周左右,而且其仪器与试剂价格更昂贵,不能解决高污染率的问题是其最大的缺陷[8]㊂1.2噬菌体法药敏试验主要有噬菌体荧光法和噬菌体裂解法㊂噬菌体荧光法即荧光素酶测定法,原理是通过检测荧光噬菌体信号强度来判断药敏结果㊂具体方法是用设计好的噬菌体携带荧光素酶,M T B生长在有抗结核药的培养基中,并被这种含荧光素酶的噬菌体感染,若菌株对这种抗结核药耐药,M T B在生长的过程中产生的A T P需要荧光素酶来发光㊂S u b r a m a n y a m等[9]评估了该方法快速检测利福平耐药的敏感性和特异性分别为90%和81%,检测时间仅需3d㊂有文献[10]报告用增强型绿色荧光蛋白噬菌体感染生长在抗结核药物中的M T B,将生长的M T B灭活后印迹在玻片上,被荧光显微镜检测到,则证明对该种抗结核药耐药㊂这种方法检测异烟肼㊁利福平㊁链霉素这三种抗结核药的敏感性达到94%,2d内检测链霉素和利福平的耐药结果,3d 内检测异烟肼的耐药结果㊂S i v a r a m a k r i s h n a n等[11]用p h A E85荧光素酶报告基因的噬菌体检测利福平耐药特异性为99%,敏感性为91%,且具有较高的可重复性㊂这种方法有较高的敏感性和特异性,但是该方法需要在液体培养基中操作而且需要较贵的发光剂㊂噬菌体裂解法是先将待检M T B菌株加入不同浓度的抗结核药物作用24~48h,然后再加入分枝杆菌噬菌体,该噬菌体感染活的M T B,并在菌体内增殖,释放出子代噬菌体又感染随后加入的速生分枝杆菌并将其裂解,这些复制的噬菌体作为一个斑块在快速生长的结核分枝杆菌内被检测到,根据琼脂平板出现的噬菌斑判定结果㊂于宏波等[12]运用噬菌体裂解法检测M T B对异烟肼㊁链霉素和利福平的药物敏感性㊂结果显示,异烟肼药物浓度为1m g/L时,其灵敏度为87%,特异度为93.3%,与传统方法的符合率为92%;链霉素药物浓度为4m g/L时,其灵敏度为96.2%,特异度为92%,与传统方法的符合率为92.9%;利福平药物浓度为5m g/L时,其灵敏度为91.4%,特异度为96.2%,与传统方法的符合率为94.7%㊂该方法检测敏感性较高,但是污染是一个问题㊂1.3显微镜观察药物敏感性测定法(m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o nd r u g s u s c e p t i b i l i t y,MO D S)MO D S的原理是使用倒置显微镜观察M T B在液体培养基中生长时所形成的索状结构来进行鉴定M T B复合群,在液体培养基中加入抗结核药物可完成抗结核药物的药物敏感试验,药敏结果报告需时仅3周㊂该方法是集分枝杆菌培养㊁菌种鉴定和药物敏感性试验为一体的新的诊断方法㊂A g a r w a l等[13]应用MO D S评估了P N B试验进行分枝杆菌菌种鉴定,结果显示2种方法的符合率为94.8%(95%C I:92.3%~96.5%),若2种方法联合检测的一致性为100%(95%C I:98.9%~ 100%)㊂M o o r e等[14]报道MO D S对于异烟肼㊁利福平㊁乙胺丁醇㊁链霉素检测药敏试验与常规方法的符合度分别为97%㊁100%㊁95%㊁92%㊂T r o l l i p等[15]使用MO D S对氟喹诺酮及二线注射剂进行折点研究,通过MO D S测定莫西沙星㊁氧氟沙星㊁阿米卡星㊁卡那霉素㊁卷曲霉素的折点分别为0.5μg/m l㊁1μg/m l㊁2μg/m l㊁5μg/m l㊁2.5μg/m l,与MG I T T M检测结果保持高度一致性㊂H u a n g等[16]使用MO D S检测M T B对吡嗪酰胺的药敏试验,与L J检测结果比较MO D S的敏感性和特异性分别为97.8%㊁96.5%㊂MO D S提供了一种快速简单可靠的检测M T B对吡嗪酰胺的药敏试验的方法,成本较低,在资源有限的国家MO D S是最佳选择㊂2M T B的基因型检测方法2.1线性探针杂交技术德国H a i nL i f e s i e n c e公司的试剂盒在国内外已经成熟开展应用,其原理是检测异烟肼的耐药基因K a t G㊁I n h A和利福平的耐药基因r p o B来判断M T B对异烟肼㊁利福平的耐药性㊂目前,线性探针杂交技术和液体培养法检测异烟肼和利福平的药敏试验的方法已被WHO 推荐为一线抗结核药药敏试验的金标准[17]㊂此方法的原理是将常见突变位点的寡核苷酸探针(简称R探针)和正常序列探针(简称S探针)分别固定于硝酸纤维素膜上,与待检测标本的M T B菌株P C R扩增产物杂交,然后加入显色系统,通过显色反应来判定抗结核药物的药敏性㊂该检测技术主要是适用于痰涂片抗酸染色阳性的标本,是目前WHO推荐的检测M D R-T B的工具之一,我国各地区均已开展该检测㊃216㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第8期I n t JR e s p i r,A p r i l2015,V o l.35,N o.8方法㊂此检测方法最快5h可出报告,大部分的标本在24~ 48h内报告结果㊂C r u d u等[18]报道了这种方法检测利福平㊁异烟肼耐药的敏感度㊁特异度分别为87.6%和99.2%㊂而印度的研究显示利福平耐药敏感度为100%,特异度可达97.3%,异烟肼耐药敏感度㊁特异度分别为91.9%和98.4%[19]㊂最新的文献[20]报道了可利用线性探针杂交技术检测M T B对氟喹诺酮的耐药基因G y r A,但是这种方法还不能替代作为金标准的M T B的培养方法来检测M T B对氟喹诺酮敏感性㊂线性探针杂交在临床上已广泛应用,该技术能快速检测MG I T培养基内M T B的耐药基因,其检测结果与D N A基因测序结果的符合率为100%[21]㊂但是其操作过程中不能自动化出结果需人工读取结果也是其重要的缺点㊂2.2 X p e r tM T B/R I F检测技术 X p e r tM T B/R I F又叫实时荧光定量P C R,本技术可将检测标本准备㊁定量P C R扩增和荧光检测集于一身,可在2h内同时完成M T B的定性和利福平耐药检测㊂最大的优势是直接对无需处理的痰标本进行检测,能最大程度地避免污染及生物危害,其操作过程简单快速㊂该方法检测利福平耐药性的基本原理是用一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针来检测M T B有无r p o B基因的突变㊂X p e r tM T B/R I F法在检测肺结核及其耐药性方面具有高度的敏感度和特异度㊂最新的研究表明X p e r tM T B/R I F可用于肺外结核的快速诊断,并且达到很高的敏感性和特异性[22]㊂H i l l e m a n n等[23]的研究报告了X p e r tM T B/R I F检测521份包括尿液㊁胃内容物㊁组织㊁胸水㊁脑脊液㊁大便的标本用于诊断肺外结核病,其总的敏感性和特异性为77.3%㊁98.2%㊂但是V a d w a i等[24]的研究表明对脑脊液的检测敏感性仅为29%,考虑可能与脑脊液中结核菌的含量低有关㊂埃塞俄比亚的B i a d g l e g n e等[25]利用X p e r tM T B/R I F对淋巴结针吸活检标本进行检测诊断淋巴结核,其敏感性和特异性分别为93.5%㊁69.2%㊂M a t h y s 等[26]报道了1例涂阳的肺结核患者经X p e r t®M T B/R I F检测为利福平耐药,而表型检测为利福平敏感,通过重复基因测序证实了存在无效r p o B基因突变导致利福平的假阳性㊂2.3芯片诊断技术与诊断方法芯片诊断技术又称D N A 微阵列,基因芯片也属于利用反向杂交检测M T B耐药相关基因的检测技术㊂此技术通过检测标本中异烟肼的耐药基因K a t G㊁I n h A和利福平的耐药基因r p o B的突变情况,从而判定是否对异烟肼和利福平耐药㊂基因芯片技术还是一种多目的高通量基因分型工具,可用于分枝杆菌的菌种鉴定,能区分14种M T B符合群和4种非结核分枝杆菌,检测精确率达98.94%[27]㊂整个操作过程简便快捷,仅需6h㊂目前国内使用的是北京博奥生物有限公司生产的基因芯片检测系统㊁M T B耐多药基因芯片检测试剂盒㊂我国评价了基因芯片技术检测肺结核患者痰液异烟肼耐药的敏感性和特异性分别为74.31%㊁96.92%,利福平耐药的敏感性和特异性分别为79.76%㊁96.53%,M D R-T B的敏感性和特异性分别为64.62%㊁97.75%[28]㊂俄罗斯对比分析了基因芯片技术与标准培养药敏试验对肺结核患者痰液异烟肼和利福平的耐药的符合率为97%[29]㊂鉴于基因芯片检测技术具有高效㊁快捷㊁经济㊁操作过程安全的优点,建议可在基层实验室中开展基因芯片对于利福平和异烟肼耐药性检测[30]㊂2.4滚环扩增技术滚环扩增技术是一种新型的核酸扩增技术,是借鉴自然界病原生物体的滚环式复制D N A的方式而提出的㊂此技术能在恒温条件下进行核酸扩增,不需要特别的扩增仪器实现对靶物质的检测㊂这种核酸扩增技术除了可应用于全基因组D N A检测㊁核酸测序㊁单核苷酸多态性检测外,还可应用于细胞原位检测㊁D N A和蛋白质芯片检测以及另外一些生物分子的分析㊂这种扩增技术具有高的扩增效率㊁好的特异性㊂滚环扩增技术在医学上已应用于对细菌㊁病毒的检测,用于临床诊断和药物的筛选㊂S t e a i n 等[31]报道了利用滚环技术检测甲型H1N1及H3N2流感病毒对于奥司他韦的耐药基因㊂目前对于M T B耐药基因的检测主要聚焦在对异烟肼㊁利福平耐药的检测,近年来滚环扩增技术也应用到了M T B的定性及耐药基因检测㊂有研究应用超分支滚环扩增技术(H R C A)对M T B进行快速检测[32]㊂该研究将研究对象分为3组,肺结核患者60例,非结核对照组包括肺癌和肺炎患者共38例,健康对照者20名,对研究对象的痰标本进行检测分析㊂结果显示60例肺结核患者检测灵敏度达到73.33%,高于涂片(41.67%)㊂而在20名健康人痰标本中,H R C A检测为阴性,特异性为100%㊂但是有2例肺癌患者的H R C A和定量P C R结果为阳性,因此H R C A对M T B检测存在一定的假阳性率㊂张江峰等[33]应用滚环扩增技术检测80株M T B耐利福平r p o B基因,其检测结果与测序结果一致,精确到能检测出1%突变型/野生型模板的样本㊂C h e n等[34]采用滚环扩增技术对124株M T B利福平耐药基因的表型进行检测,该方法的敏感性和特异性分别为96.6%㊁89.5%,该方法是快速㊁简单㊁经济㊁潜在高通量耐多药M T B的方法,尤其是在资源有限的耐药结核病高流行区㊂也有研究比较分析了滚环扩增技术㊁多重等位基因特异P C R㊁测序k a t G㊁f a b G1-i n h A启动子区域3种方法检测异烟肼耐药基因,阳性率分别为68%㊁71%㊁74%,认为滚环扩增技术是一种快速经济检测异烟肼耐药的方法[35]㊂目前关于M T B的耐药性检测技术还包括S a n g e rD N A 测序和焦磷酸测序技术㊁变性高效液相色谱技术㊁高分辨熔链曲线分析术等㊂但是以上这些检测技术还在研究阶段,尚缺乏系统的方法学评价及与标准的培养方法学之间的比较,而且多集中在异烟肼㊁利福平及部分一线抗结核药的药敏检测,对于非一线抗结核药物的药敏试验还不成熟㊂吡嗪酰胺可作为关键的一线抗结核药之一,但目前对吡嗪酰胺的体外药敏检测仍然是一个挑战㊂虽然最近有文献[36]报道双向介质法在罗氏培养基上检测19株M T B菌株在体外对吡嗪酰胺的敏感性,p H值5.2或5.5,临界浓度为66m g/L,重复性达95%,但仍需大样本多中心的研究来验证㊂同时我们也期待着检测技术的检测标本不仅仅局限于痰标本,能对微量低浓度的样本如血液㊁浆膜腔液㊁脑脊液㊁B A L F等,甚至于组织完成M T B的直接检测和药敏试验,真正为耐药结核病㊃316㊃国际呼吸杂志2015年4月第35卷第8期I n t JR e s p i r,A p r i l2015,V o l.35,N o.8快速诊断提供精准的诊断工具㊂参考文献[1] W r i g h tA,Z i g n o l M,V a n D e u n A,e ta l.E p i d e m i o l o g y o fa n t i t ub e rc u l o s i sd r u g re s i s t a n c e2002-07:a nu p d a t e da n a l y s i so f t h eG l o b a lP r o j e c to n A n t i-T u b e r c u l o s i sD r u g R e s i s t a n c eS u r v e i l l a n c e[J].L a n c e t2009,373(9678):1861-1873. 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NanoDisk-MS：一种结核病快速准确诊断和治疗监测的创新技术
NanoDisk-MS：一种结核病快速准确诊断和治疗监测的创新技术结核病是威胁人类健康的重大疾病。
2030年终结全球结核病流行是联合国可持续发展目标之一。
然而，WHO监测数据显示，2015年全球活动性结核新发病例1040万人，结核病死亡180万人，与上一年度相比，新发病例、死亡病例数均不降反升[1]。
由于缺乏有效的疫苗、耐药菌株的出现、诊断技术性能不佳、基于培养技术的治疗评价耗时长，结核分枝杆菌这种地球上迄今为止最为成功的病原体[2]，使人类在终结结核病流行的战役中面临严峻挑战。
控制结核病疫情的关键是早期诊断和有效治疗。
目前，临床上可供选择的诊断技术均存在一定的局限性。
广泛应用于初诊患者的抗酸杆菌涂片显微镜检查技术，除敏感性无法满足要求外，还受标本采集的影响，对于不咳痰的肺结核患者或取材困难的肺外结核患者难以诊断。
培养技术是目前结核病诊断的“金标准”，虽可以获得结核分枝杆菌用于药物敏感性试验，但存在与显微镜检查技术同样的不足，且耗时达数周之久，严重影响了该技术在结核病诊断方面的实际应用价值[3]。
以GeneXpert为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌特异性高，且可以在2小时内报告是否为结核分枝杆菌感染及利福平耐药。
然而，该法不能区分活菌和死菌，且对于菌阴肺结核以及某些肺外结核的检测敏感性低[4]。
传统的免疫学方法如结核菌素皮肤试验（TST）因受卡介苗及环境分枝杆菌的影响，在诊断结核分枝杆菌感染时特异性低。
新一代免疫学技术，如Gamma-干扰素释放试验（IGRA），虽然不受卡介苗及大多数环境分枝杆菌的影响，但不能区分活动性与潜伏性结核感染，对活动性结核的诊断特异性差，这在结核病高负担国家尤为突出[5]。
因此，迫切需要研发快速、无创、可定量、敏感性高、特异性好，尤其是不基于痰标本的结核病诊断新技术，以有效诊断各类人群活动性肺结核，以及快速评估临床治疗效果以应对逐渐增多的耐药结核菌感染。
令人兴奋的是，最近美国亚利桑那州立大学的胡晔等在PNAS上发表文章，公布了一项将抗体标记、能量聚集纳米盘与高通量质谱技术相结合的方法（NanoDisk-MS，纳米盘-质谱技术）用以检测经消化的血清样本中结核特异性抗原肽。