PCR产物的T载体连接和转化ppt课件
PCR的基本原理和应用 PPT课件
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR、载体构建及转化
挑菌
准备工作: 1、提前打开37℃摇床，开紫外灯杀菌。 2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头， 镊子，Amp抗性的LB液体培养基。 步骤： 1、将Amp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管46ml。 2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试 管中。 3、盖上试管盖，置摇床中，37℃，170转摇培过夜 （16-18小时）。
1在超净台内将试管中的菌液移入15ml离心管中21000rpm离心10min其间取si和rnase3弃上清留沉淀4每管加入100lsi和rnase04lrnasea浓度为100mgml可提前算好总的si和rnasea用量混匀后分装于离心管中5充分涡旋均匀6计算好sii用量临时将04nnaoh2sds等体积混合于灭菌的三角7每管加入混合好的sii200l轻轻上下颠倒几次dna8插入冰盒中静置5min此时菌液变的清亮粘稠9每管加入siii150l上下颠倒数次此时有白色絮状沉淀出现
引物设计常用软件： DNAstar：序列分析
Primer5.0：引物设计
DNAman：序列比对 在线引物设计： http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
2. 载体构建
T-Vector连接
反应体系： • 2×Ligation Buffer 2.5µl • Inset fraction 1.5µl • T-easy vector 0.5µl • T4-ligase 0.5µl 混匀后置16℃连接0.5- 小时。
蓝白斑筛选：
• 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
•设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型 菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。 •操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子， 在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。 •当外源DNA与含lacz‘的载体连接时，会插入进MCS，这种 重组质粒不再表达α 肽链，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可 分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
PCR产物的T载体连接和转化
将阳性克隆扩大培养，用灭菌的甘 油按比例与培养液混合，保存于80℃低温冰箱中。
04 PCR产物的应用
克隆基因的表达
克隆基因的表达是PCR产物应用的重要领域之一。通过将目的基因克隆到表达载 体中，可以实现在宿主细胞中的高效表达，从而获得大量的重组蛋白。
克隆基因的表达有助于研究基因的功能、蛋白质的结构和性质，以及开发新的药 物和治疗方法。
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使用高质量的感受态细胞，确保其处于良 好的生长状态。
优化连接条件，如连接时间、温度、酶产物浓度，可以提高转化效率。
克隆基因表达不理想的问题及解决方案
问题：克隆基因表达量低 或未表达。
确认目的基因的ORF是否 正确，是否有基因缺陷或
突变。
优化表达条件，如温度、 pH、诱导剂浓度等。
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解决方案
对PCR产物进行测序验证， 确保目的基因的序列正确。
对于关键突变，可以通过 定点诱变技术进行精确的 基因改造。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
解决方案
选择合适的宿主菌，有些 基因在特定的宿主菌中表
达较好。
添加基因表达增强剂，如 使用稀有密码子或增强子
序列。
基因突变研究中的问题及解决方案
问题：基因突变导致功能 丧失或表达异常。
使用高保真酶进行PCR扩 增，减少突变的发生。
在突变研究中，考虑使用 互补DNA（cDNA）代替 基因组DNA。
01
基因突变的研究
基因突变是生物多样性和进化的重要 驱动力。通过PCR技术，可以快速、 准确地检测和鉴定基因突变，研究其 产生机制和生物学意义。
基因突变的研究有助于了解人类遗传 性疾病的发病机制、药物抵抗和癌症 发生等生物学过程，为疾病诊断和治 疗提供依据。
T载体的克隆
实验原理重组质粒的构建T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
感受态制备原理细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。
β-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
T载体连接测序
1.1.1目的片段的回收将在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳的PCR产物目的条带小心切下，用博大泰克公司生产的DNA片段回收试剂盒回收。
具体操作如下：（1）先算出胶块克数，然后按1：3比例加入溶胶液（以100μL体积胶加入300μL溶胶液为一个标准反应），室温下放置5min或50℃保温3min，期间轻摇离心管几次，使胶完全融化；（2）加入10μL玻璃奶，颠倒混匀，冰浴放置10min，每隔2-3mim混匀一次；12000r/min离心30s，吸弃上清；（3）加入250μL漂洗液，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶混匀；12000r/min离心30s，吸弃上清，并重复该步骤一次；（4）吸取完漂洗液后再离心10s，用枪头将最后一点漂洗液吸干净，放置于37℃烘干直至沉淀变白，约15min；（5）加入适量的洗脱液（20μL为一个标准反应）混匀，60℃水浴5min，12000r/min离心1min，吸取上清备用。
1.1.2目的片段与T载体的连接将玻璃奶回收的目的片段1.5μL与北京全式金公司的的pEASY-T3 vector 1μL混合，常温反应5-10min，转化DH5α感受态细胞。
1.1.3感受态细胞E.coli DH5α的制备（1）从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37℃下振荡过夜培养，直至对数生长后期。
（2）将该菌悬液以1:100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃, 200r/min荡培养2.5小时至OD600＝0.3-0.4，将烧瓶取出放置冰上10~15min。
（3）在无菌条件下把菌液倒入50mL预冷的离心管中。
4℃4000 r/min离心10min。
（4）弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。
加10mL0.1M冰浴冷的CaCl2到离心管中，反复吹打，混匀菌体，冰浴20min。
（5）4℃,4000 r/min离心10min，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液，加入4mL0.1M 冰浴冷的CaCl2及15%甘油，重悬浮菌体。
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
PCR技术详解ppt课件
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间 的非特异性结合，提高PCR反应的特异性
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③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 • 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
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低浓度引物
高浓度引物
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3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多 重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的 存在或缺失。
引物
电 泳
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4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量 功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一 轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓 度
3
• 1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人 发明了聚合酶链反应（PCR） • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错，未能推广 • 1988 年 ， Saiki 等 人 从 嗜 热 杆 菌 (thermus aquaticus) 中 提 出 TaqDNA 聚 合 酶 ， 使 得 PCR技术得以广泛应用 • 1993 年， Mullis 等因此项技术获诺贝尔化 学奖
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PCR产物的T载体连接和转化
PCR产物的A尾巴和T载体
连接酶
T4 DNA Ligase 1967
酶连 将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心 管中，加入0.5μL T载体，加5μL 2×连 接buffer，16℃连接反应12小 E.coli DH5α感受态细胞转移至无菌离心管 中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃ 的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟， 每管加800ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育 45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗 性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/L MgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于 室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，1216小时后可出现菌落。
PCR原理ppt课件
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
PCR产物的T载体连接和转化
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4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的 错儿。 11:01:1 411:01: 1411:0 1Saturday, December 12, 2020
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5、知人者智，自知者明。胜人者有力 ，自胜 者强。 20.12.1 220.12. 1211:0 1:1411: 01:14D ecembe r 12, 2020
PCR产物的T载体 连接和转化
PCR产物的A尾巴和T载体
连接酶
T4 DNA Ligase 1967
酶连
将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心 管中，加入0.5μL T载体，加5μL 2×连 接buffer，16℃连接反应12小时以上。
转化
取200ul E.coli DH5α感受态细胞转移至无菌离心管 中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃ 的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟， 每管加800ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育 45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗 性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/L MgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于 室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，1216小时后可出现菌落。
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1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 2.1220. 12.12Sa turday, December 12, 2020
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2、阅读一切好书如同和过去最杰出的 人谈话 。11:0 1:1411: 01:1411 :0112/ 12/2020 11:01:14 AM
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3、越是没有本领的就越加自命不凡。 20.12.1 211:01: 1411:0 1Dec-20 12-Dec-20
PCR详细讲解PPT课件
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
2021/3/7
CHENLI
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2021/3/7
普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
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引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
2021/3/7
CHENLI
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引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
2021/3/7
CHENLI
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Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
2021/3/7
CHENLI
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
PCR技术PPT课件
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
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10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
连接与转化
蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz ’的基因，lacz’ 中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段； 一个 多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是 外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽 链的功能活性。
LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色
底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会
实验流程（转化需要无菌操作）
连接产物 或质粒
冰浴3min 加入
200 µL感受态
冰浴30min
42 ℃ 90s
1 mL 37℃预热LB
37 ℃ 60min
振荡培养
加入5 µL X-gal、 5 µL IPTG
4 ℃ 3000r/min 10min
倒掉上清，留下 约200 µL
37 ℃
37 ℃
涂板，正面向上 30min
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因 。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中 含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N 端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用 X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
T-载体与PCR产物连接
TA克隆方法：把PCR片断与一个具有3 ’-T聚合酶同时具有的末端连接酶的 功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个 3`-A突出端。用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA 片断才能通过T/A配对进行连接。
倒置培养过夜
蓝白斑筛选
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
PCR技术ppt课件
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
T-载体连接方案
T-载体连接全过程第一步：PCR扩增目的基因及纯化1. PCR反应体系：10×扩增缓冲液 5.0ul10mMdNTP 1.0ul引物1 1.0ul引物2 1.0 ul模板DNA 1.0ulTaq DNA聚合 1.0ul加双蒸水至50ul（相同的引物体系可配置PCR MIX体系）2. PCR反应条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
95℃ 5min95℃ 45s40～60℃ 50s 循环 35次72℃ 55s72℃ 10min3. PCR期间配置琼脂糖凝胶：PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。
4. PCR产物回收（1）单一PCR产物用氯仿法●把PCR产物转移至1.5ml的离心管，加500ul无菌水，500ul氯仿异戊醇（24:1）,混匀后10000rpm离心5-10分钟●转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入2倍体积（780 µL体积即可）的无水乙醇与40ul3MNaAc。
置冰上或-80℃冰箱30分钟以上。
●10000 rpm离心10 min。
弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。
小心不要将沉淀洗掉。
●置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味，大至要5~10min。
●加入40 µL 无菌水溶解沉淀备用。
（2）多条带PCR产物用切胶回收试剂盒。
●PCR产物进行琼脂糖电泳（大容量上样系统）●切胶并回收目的条带至1.5ml的离心管，称重。
●参照试剂盒说明书进行操作（附录3）。
●用50ul无菌水洗脱离心柱2次备用。
第二步：T-载体连接和转化准备工作：制备感受态细胞，方法见附录一，LB培养基，Amp母液，氯化钙的配制，方法见附录二；1.在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：注：T-载体试剂盒开封前要向pMD18-T Vector 管中加入25 ul 无菌水，同时再管上面做标记。
pMD18-T Vector 1.0 ul外源DNA 1.5 ulSolutionI 2.5 ul2.16℃或4℃低温连接1h-2h（最好过夜）；3. 连接产物全量加入50 ul 的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置30min；DH5α感受态细胞加5 ul 0.1M的无菌氯化钙做阴性对照；4. 热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。
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1
PCR产物的A尾巴和T载体
2
连接酶
T4 DNA LigasБайду номын сангаас 1967
3
酶连 将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心
管中，加入0.5μL T载体，加5μL 2×连 接buffer，16℃连接反应12小时以上。
4
转化
5
取200ul E.coli DH5α感受态细胞转移至无菌离心管 中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃ 的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟， 每管加800ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育 45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗 性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/L MgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于 室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，1216小时后可出现菌落。
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