魔芋软腐病病原菌的鉴定及生物学特性初步研究_黄俊斌

魔芋软腐病病原菌的鉴定及生物学特性初步研究黄俊斌1)　邱仁胜1)　赵纯森1)　向发楚2)　黄维涨2)　杨　东2)(1)华中农业大学植保系,武汉430070;2)中日合资湖北楚业魔芋食品有限公司,恩施445000)摘要　对魔芋软腐病病原菌的致病性测定、形态特征和生理生化特性的研究结果表明:魔芋软腐病由胡萝卜软腐欧氏杆菌(Er winia ca rotovora pv .caratovo ra )引起,病原菌的生长最适温度为25～30℃,最适酸碱度为pH6.0～6.5,最适碳源为乳糖,最适氮源为酵母汁。

关键词　魔芋;软腐病菌;生物学特性中图法分类号　S 432.4+2 魔芋(Am orphallus konjac )属天南星科多年生草本植物,其制品目前广泛用于磁带、纺织、建筑、印染、造纸、石油钻探等多种行业。

内服魔芋制品有燥湿化痰、健脾、降血脂、清胆固醇等作用[1]。

魔芋软腐病是魔芋生产上为害最严重的病害。

湖南、湖北、四川、云南等省均有发生;在国外以日本发病最为严重[2～4]。

湖北省魔芋软腐病主要发生在鄂西自治洲和郧阳地区一带,近两年来,在田间和室内贮藏期发生严重,可引起产量损失50%～70%。

为了探索有效的防治方法,我们于1998～1999年对引起该病的病原菌的致病性、形态特征、生理生化特性和生物学特性等进行了初步研究,现将结果报道如下。

1　材料与方法1.1　供试材料病株采自湖北鄂西自治州魔芋种植基地。

魔芋的叶片、叶柄和地下球茎都表现症状。

叶片发病,产生湿润暗绿色小斑,或病斑愈合,组织软腐;叶柄受害,产生水渍状长条斑,软腐;球茎感病后,发病部位表面呈暗褐色水渍状斑,腐烂部位呈灰色或灰褐色粘液状。

1.2　病菌的分离及致病性测定采用稀释分离法从球茎发病处分离到细菌,然后用平板划线单菌落法进行纯化,用纯化的细菌作致病性测定。

致病性测定方法是:将健康的球茎用95%的酒精表面消毒,后用灭菌刀片将其切成2.5c m 3的小块,置于保湿的培养皿中。

接种前用消毒的挑针将各球茎块刺成微伤口,然后接上分离到的细菌悬浮液,细菌浓度为108个/ml ,同时,用灭菌水作对照。

将上述处理过的球茎分别置于20℃、25℃、30℃和35℃的恒温箱中培养,接种后第2～4d ,观察记录症状表现。

1.3　病原菌的鉴定在肉汁胨琼脂培养基上观察菌株的培养性状和菌体形态。

革兰氏染色、鞭毛染色、糖类发酵、硝酸盐还原、过氧化氢反应、淀粉水解、酪氨酸水解、明胶水解、耐盐性(5%NaCl )等特性测定参照文献[5～7]进行。

1.4　病原菌的生物学特性1)细菌母液的制备。

先将保存的菌种接于PDA 斜面上在30℃下活化24h ,然后接活化的菌苔于装有100ml NB 培养液(牛肉膏3g 、蛋白胨5g 、氯化钠5g 、蒸馏水1000ml )的250ml 三角瓶中,30℃下振荡培养48h 。

2)温度对病原细菌生长的影响。

接0.2ml 活化的菌液于含有5.0ml NB 培养液的试管中,接种后置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下培养48h ,测定620nm 处的吸光度。

3)pH 对病原细菌生长的影响。

将NB 培养液分别调到pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。

接种0.2ml 菌液于含有5.0ml NB 培养液的试管中,30℃下培养48h ,测定620nm 处的吸光度。

4)病原细菌对不同碳源的利用。

在基础培养液收稿日期:1999 07 07黄俊斌,男,1963年生,博士,讲师.工作单位:华中农业大学植保系,武汉430070第18卷第5期1999年　10月华　中　农　业　大　学　学　报Journal of Huazhong Agricultural University Vol .18　No .5Oct .　1999(KH2PO41.36g,K2HPO40.5g,CaCl2·2H2O0.1g, NaH2PO4·H2O0.5g,MgSO4·7H2O0.2g,蒸馏水1000 ml)中分别加入1%的葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、山梨糖、可溶性淀粉、0.5%的甘露醇,将pH 调节到7.0,分装试管,灭菌30min。

接种0.2ml菌液于含有5.0ml NB培养液的试管中,30℃培养48 h,测定620nm处的吸光度。

5)病原细菌对不同氮源的利用。

在基础培养液(K2HPO41.36g,NaH2PO42.13g,MgSO4·7H2O0.2g, FeSO47H2O0.0005g,CaCl2·2H2O0.005g,蒸馏水H2O1000ml)中分别加入0.1%的KNO3、0.3%的牛肉膏、酵母汁、蛋白胨、干酪素,分装试管后灭菌。

接种0.2ml菌液于含有5.0ml NB培养液的试管中,置30℃下培养48h,测定620nm处的吸光度。

2　结果与分析2.1　病原菌的致病性测定用分离纯化所得到的细菌对健康的魔芋球茎进行的致病性测定结果表明:接种后第2d,所有处理的芋块不表现腐烂症状。

接种后第3d,在20℃、25℃和30℃下芋块开始表现腐烂症状,其中以25℃和30℃腐烂速度最快,腐烂面积约占1/15左右。

在35℃下芋块不表现腐烂症状。

接种后第4d,在25℃和30℃下芋块腐烂面积约占2/3,在35℃下仍未观察到芋块腐烂。

2.2　病原菌的鉴定1)形态特征。

在肉汁胨琼脂平板上培养48h,菌落呈乳酪白色,圆形,大多数直径为0.3～0.6 mm,中央突起。

菌体短杆状,大小为1.2～2.5μm×0.55～1.1μm,革兰氏染色阴性,鞭毛周生,多数为3～6根。

2)生理生化特性。

软腐菌能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖,产酸不产气;硝酸盐反应、酪氨酸水解、淀粉水解反应为阴性;过氧化氢、明胶水解,酪素水解为阳性;能在含5%NaCl的培养液和37℃下生长(表1)。

2.3　病原细菌的生物学特性1)不同温度对软腐菌生长的影响。

供试软腐菌在温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下培养48h后,其在620nm处的吸光度分别为0.236、0.316、0.343、0.186、0.073、0.038、0.036。

由此可见,软腐菌最适生长温度为25～30℃。

2)不同pH对软腐菌生长的影响。

经测定,供试软腐菌在pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0时,其在620nm处的吸光度分别为0.043、0.051、0.248、0.630、0.665、0.731、0.632、0.565、0.471、0.335、0.127。

由此可见,在pH4.0～4.5不利于软腐菌的生长,软腐菌生长的最适pH为6.0～7.0。

表1　软腐菌的生理生化特性Table1　The physiological an d biochemical characterof s oft rot bacteria特性Character结果1)Result 过氧化氢H2O2+淀粉水解Starch hydrolysis-酪素水解Cas ein hydrolysis+酪氨酸水解Tyros ine hydrolysis-37℃下生长Growth at37℃+5%氯化钠5%NaCl+明胶水解Gelatin hydrolysis+硝酸盐还原Nitrate reduction-糖类发酵产酸Acid productionof carbohydratefer ment蔗糖Acid production of s ucrose ferment+乳糖Acid production of lactos e ferment+葡萄糖Acid production of glucose ferment+麦芽糖Acid production of maltos e ferment+ 1)“+”表示阳性反应,“-”表示阴性反应　“+”positive reaction,“-”negative reaction3)软腐菌对不同碳源的利用。

表2　软腐菌对不同碳源利用Table2　Different carbon s ource for the growth of soft rot bacteria 碳源Carbon s ource吸光度A620nm 果糖Fractose0.236葡萄糖Glucose0.286蔗糖Sucrose0.498乳糖Lactos e0.508麦芽糖M altose0.369山梨糖Sorbitol0.411可溶性淀粉Soluble starch0.411甘露醇M annitol0.358从表2可以看出,软腐菌能很好地利用乳糖、蔗糖、山梨糖、可溶性淀粉作为唯一的碳源,最适合碳源为乳糖。

4)软腐菌对不同氮源的利用。

从表3可以看出软腐菌能很好的利用酵母汁、蛋白胨、牛肉膏作为唯一氮源,最适氮源为酵母汁。

414 华中农业大学学报第18卷　表3　软腐菌对不同氮源的利用Table 3　Different nitrogen source for the growth of s oft rot bacteria碳源Carbon s ource 吸光度A 620nm硝酸钾Potas sium nitrate 0.348蛋白胨Peptone 0.531酵母汁Yeast extract 0.808干酪素Cas ein 0.498牛肉膏Beef extract0.6913　讨　论综合对魔芋软腐病菌的致病性测定,软腐菌的形态学特性,生理生化特性研究结果,根据伯捷氏细菌手册[7]和植物病原细菌分类和鉴定[8]中所描述的特征可以确定魔芋软腐菌病是由胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜致病变种(Erwinia carotov ora pv .c arotovora )引起。

这与前人的报道结果一致[1～4]。

但也有胡萝卜欧氏杆菌黑胫变种引起魔芋软腐病的报道[9]。

我们还不能排除不同地理来源的菌株存在不同亚种的可能性。

最近Persson 报道使用气相色谱仪对胡萝卜软腐亚种和黑胫亚种的脂肪酸进行分析,能迅速将二者分开来[10]。

这将有利于魔芋软腐病菌快速、准确的鉴定。

不同温度与软腐病菌的致病性研究结果表明在25℃和30℃下芋块腐烂最快,这与病菌最适生长温度为25～30℃相吻合。

而在此温度范围下也正是魔芋软腐病在田间的发生高峰期。

在室内30℃下接种未观察到芋块的腐烂症状,这可能是由于高温不利于软腐菌的生长以及高温加速芋块表面褐化抑制病菌侵入的原因所致。

致谢　本研究得到华中农业大学植保系周茂繁教授的指导,谨致谢意!参　考　文　献1　卫扬斗,赵纯森,周胜德.魔芋病害及其防治技术的初步研究.中国蔬菜,1988,(2):32～342　王国馨,罗灿辉,刘克颐.魔芋软腐病的研究.湖南农学院学报,1989,15(2):50～573　Hayas hi N .The seed corm trans miss ion of konnyaku 's (Amor phophallus konj ac )soft rot caused by Erwinia carotovora subsp .car otovora .Gunma J ournal of Agricultural Res earch ,A (General ),1988,5:25～344　Hays hi N ,Tachikawa Y ,Suwa S ,et al .The agrotechnical control and vari -etal resistance of soft rot and bacterial leaf bl ight of konnyaku (Amor -phophallus konjac ).Gunma Journal of Agricul tural Research ,A (Gener -al ),1988,5:35～485　周庆德.微生物学实验手册.上海:上海科技出版社,1986.16～1366　方中达.植病研究法.北京:农业出版社,1979.189～1907　Holt J G .The s horter Bergey 's Manual of Determinative Bacteriology .Eight Edition .Baltimore :The willia ms and wil kians copmany ,1977,124～1268　任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定.北京:北京农业出版社,1994.86～1069　周茂繁,鲍迪富,赵纯森等.中国药用植物病虫图谱.湖北:湖北科学技术出版社,1998,23210　Persson P ,Slette A .Fatt y acid analysis for the identification of Er winiacarotovora s ubs p .atr os eptica and Er winia car otovor a s ubsp .carotovora .Bulletin OEPP ,1995,25:151～156THE PRILIMINARY STUDIES ON THE BIOLOG ICAL CHARACTER AND IDENTIFICATION OF KONNYAKU 'S S OFT ROT BACTERIAHuang Junbin 1)　Qiu Rensheng 1)　Zhao Chunsen 1)　Xiang Fachu 2)　Huang Weizhang 2)　Yang dong 2)(1)Huazhong A gricultural Unive rsity ,W uhan 430070;2)The Sino -Japen Joint V enture Chuye konnyaku 's Food Ltd C ompany ,Enshi 445000)ABSTRAC T Pathogenicity ,morphological character ,physiological and biochemical characters of bacteria iso -lated fr om diseased konnyaku (A morphallus konjac )were studied and the r esults sho wed that konnyaku 's soft rot wascaused by Erwinia carotovora pv .carotov ora .The optimum temperature ,pH ,carbon source and nitrogen source for the gr owth of soft rot bacteria was 25～30℃,6.0～6.5,lactin and yeast extract ,respectively .KEY WOR DS A morphallus konjac ,soft rot bacteria ,biological character415　第5期黄俊斌等:魔芋软腐病病原菌的鉴定及生物学特性初步研究。