第四章 动物细胞融合
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胞毒性和粘度也随之增大。
• PEG的处理时间:时间较短，一般1-10分钟
PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操作 简单，诱导率较高，是目前最常用方法。
3．电融合法：
电融合技术的原理：
悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中 的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的非均匀 交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子， 而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持
下直接观察、跟踪、 鉴定，可控性好。
小结：几种融合方法的比较
• 病毒融合的特点： ①需培养大量病毒，若灭活不充分，可能感染操作者。 ②操作复杂，融合率比较低, 可重复性不够高。 • PEG诱导细胞融合的特点： ①容易制备和控制，活性稳定，使用方便，融合能力强 ②有毒，易损伤细胞
• 电融合的特点 ①融合频率高，操作简便快捷，重复性强，对细胞伤害小 ②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞 ③非特异性融合
第四章 动物细胞融合
• 主要学习内容：
1.动物细胞融合的原理 2.动物细胞融合的方法 3.融合细胞的筛选
第一节 细胞融合的生物学基础
• 一、概念和目的 • 细胞融合：自然或人工条件下，两个或两个 的细胞合并形成单个细胞的过程。
• 目的：用于体细胞杂交，获得杂种优势。
细胞融合的一般过程
凝集
膜融合
质融合
三、细胞融合的影响因素（p113）
• 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面 性质、亲本细胞的亲缘关系） • 2.融合条件（温度、pH值、氧气） • 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50— 100mmol/L）
Βιβλιοθήκη Baidu、融合细胞的筛选与克隆 （p111、p120）
• • • • • • 一、融合子的筛选 遗传互补筛选法：HAT筛选 营养缺陷型互补筛选法 药物抗性互补筛选法 生长特性筛选法 温度敏感筛选法
存活
死亡
二、融合细胞的鉴定
• 1.细胞学鉴定：染色体鉴定
• 2.生化分析：同工酶谱分析 • 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术
三、融合细胞的克隆化培养
• 1、有限稀释法
• 通过有限次数的稀释，使96孔细胞培养板中平均 每孔仅含一个细胞的操作方法。
例如：
1.先取1.0 ml 5×104ml细胞+4ml培养基稀释， 得1×104/ml. 2.取0.5ml 1×104ml细胞液+4.5ml培养基稀释， 得1×103/ml. 3.取1.0ml 1×103ml细胞液+9.0ml培养基稀释， 得1×102/ml.
核融合
二、融合方法 1.病毒诱导融合：
灭活的 病毒既保留 了诱导细胞 融合的能力， 又不会感染 细胞。
使用仙台病毒诱导细胞融合步骤
1. 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心
2. 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液， 置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 3. 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使其 进行融合 4. 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性 培养基进行培养。
• 2、半固体培养法
• 3、单细胞显微操作法 • 4、流式细胞分选法
第三节 动物细胞融合技术的应用
• 一、生产单克隆抗体
• 二、基因定位和绘制人类基因图谱 • 三、肿瘤免疫和致瘤性分析
• 四、细胞核移植技术
• 五、向细胞内引入大分子物质
本章作业思考
• 1、名词解释 体细胞杂交
有限稀释法
• 2、总结细胞融合的三种常用方法及特点。 • 3、简述HAT培养及筛选杂交瘤细胞的原理。
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
外源性途径(旁路途径)
DNA
T
胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase)
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+
骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
H
续时间的直流高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接
触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。
电融合技术优点
①对细胞损伤小。
②融合效率高。
电融合技术缺点
• 最大的不利之处是 仪器的购置。 • 在融合大小不同的 细胞时存在问题。 • 在融合膜成分不同 的细胞时存在困难。
③融合方法快速，可
重复性强。
④融合细胞可在光镜
2．化学诱导融合
它们主要包括聚乙二醇（PEG）、二
甲基亚砜（DMSO）、甘油、醋酸酯、油
酸盐、脂质、钙离子配合物等。
其中则以PEG的使用最为广泛。
PEG诱导细胞融合的效果：
• PEG分子量大小:1000－6000,常用4000。
• 浓度:30－60％，常用50%。
• PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细
• PEG的处理时间:时间较短，一般1-10分钟
PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操作 简单，诱导率较高，是目前最常用方法。
3．电融合法：
电融合技术的原理：
悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中 的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的非均匀 交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子， 而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持
下直接观察、跟踪、 鉴定，可控性好。
小结：几种融合方法的比较
• 病毒融合的特点： ①需培养大量病毒，若灭活不充分，可能感染操作者。 ②操作复杂，融合率比较低, 可重复性不够高。 • PEG诱导细胞融合的特点： ①容易制备和控制，活性稳定，使用方便，融合能力强 ②有毒，易损伤细胞
• 电融合的特点 ①融合频率高，操作简便快捷，重复性强，对细胞伤害小 ②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞 ③非特异性融合
第四章 动物细胞融合
• 主要学习内容：
1.动物细胞融合的原理 2.动物细胞融合的方法 3.融合细胞的筛选
第一节 细胞融合的生物学基础
• 一、概念和目的 • 细胞融合：自然或人工条件下，两个或两个 的细胞合并形成单个细胞的过程。
• 目的：用于体细胞杂交，获得杂种优势。
细胞融合的一般过程
凝集
膜融合
质融合
三、细胞融合的影响因素（p113）
• 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面 性质、亲本细胞的亲缘关系） • 2.融合条件（温度、pH值、氧气） • 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50— 100mmol/L）
Βιβλιοθήκη Baidu、融合细胞的筛选与克隆 （p111、p120）
• • • • • • 一、融合子的筛选 遗传互补筛选法：HAT筛选 营养缺陷型互补筛选法 药物抗性互补筛选法 生长特性筛选法 温度敏感筛选法
存活
死亡
二、融合细胞的鉴定
• 1.细胞学鉴定：染色体鉴定
• 2.生化分析：同工酶谱分析 • 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术
三、融合细胞的克隆化培养
• 1、有限稀释法
• 通过有限次数的稀释，使96孔细胞培养板中平均 每孔仅含一个细胞的操作方法。
例如：
1.先取1.0 ml 5×104ml细胞+4ml培养基稀释， 得1×104/ml. 2.取0.5ml 1×104ml细胞液+4.5ml培养基稀释， 得1×103/ml. 3.取1.0ml 1×103ml细胞液+9.0ml培养基稀释， 得1×102/ml.
核融合
二、融合方法 1.病毒诱导融合：
灭活的 病毒既保留 了诱导细胞 融合的能力， 又不会感染 细胞。
使用仙台病毒诱导细胞融合步骤
1. 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心
2. 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液， 置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 3. 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使其 进行融合 4. 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性 培养基进行培养。
• 2、半固体培养法
• 3、单细胞显微操作法 • 4、流式细胞分选法
第三节 动物细胞融合技术的应用
• 一、生产单克隆抗体
• 二、基因定位和绘制人类基因图谱 • 三、肿瘤免疫和致瘤性分析
• 四、细胞核移植技术
• 五、向细胞内引入大分子物质
本章作业思考
• 1、名词解释 体细胞杂交
有限稀释法
• 2、总结细胞融合的三种常用方法及特点。 • 3、简述HAT培养及筛选杂交瘤细胞的原理。
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
外源性途径(旁路途径)
DNA
T
胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase)
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+
骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出
不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
H
续时间的直流高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接
触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。
电融合技术优点
①对细胞损伤小。
②融合效率高。
电融合技术缺点
• 最大的不利之处是 仪器的购置。 • 在融合大小不同的 细胞时存在问题。 • 在融合膜成分不同 的细胞时存在困难。
③融合方法快速，可
重复性强。
④融合细胞可在光镜
2．化学诱导融合
它们主要包括聚乙二醇（PEG）、二
甲基亚砜（DMSO）、甘油、醋酸酯、油
酸盐、脂质、钙离子配合物等。
其中则以PEG的使用最为广泛。
PEG诱导细胞融合的效果：
• PEG分子量大小:1000－6000,常用4000。
• 浓度:30－60％，常用50%。
• PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细