药品的无菌检查

（二） 菌液制备
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠菌
接种 肉汤培养基或
新
营养琼脂培养基
鲜
培
硫乙醇酸盐
养
流体培养基
物
改良马丁培养基或
改良马丁琼脂培养基
培
30～ 35℃
24 ～ 48
养
h
23～
28℃Biblioteka 上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含 菌数小于100 cfu(菌落形成单位)的菌悬液。
10
其他医疗器具 整个器具体③（切碎或拆开) 20①
①.每种培养基各接种10支供试品。 ②.抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验量 为6瓶（支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。 ③. 如果医用器械体积过大,培养基用量可在2000ml以上，将其 完全沉没 .
（三）培 养基 用量
金黄色葡萄球菌、
接种
铜绿假单胞菌、
枯草芽孢杆菌、
生孢梭菌（各2支） 空
接种量为1ml（小于100cfu）
白 对
照
接种
白色念珠 培养5 d 菌，黑曲 霉各2支
逐
培养3 d
日 观
察
培养5 d 结 果
9ml
（四） 结果 判定
空白对照管应无菌生长 加菌培养基管均生长良好
判该培 养基的 灵敏度 检查符 合规定
培养基的无菌性和灵敏度检查合 格后就可进行无菌检查方法学的 验证试验与无菌检查。
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第四节 无菌检查方法学的验证试验
为什么要进行方法学的验证？目的,为了保证检 验的准确与真实，保证检验的严谨性。国外药典很 早就有了无菌检查方法学的验证试验，《中国药典》 (2005年版)开始收载方法学的验证，并规定：当建 立药品的无菌检查法时，应进行方法验证试验，以 证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药 品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重 新验证。
无菌检查法目的意义保证无菌检查的药品安全。人们 很早就认识到应对此类制剂进行无菌检查。所以无菌检 查是药品卫生学检验最早的项目和各国药典最早收载的 检验内容，上世纪初就列入要求项目。
《中国药典》从1953年版开始就收载该项检验内容， 并且方法学不断完善。它在保证人民用药安全方面有着 十分重要的意义。据统计，《中国药典》（2005年版） 共有238个单列品种规定要进行无菌检查。
（五） 阴性对照
供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀 释剂同法操作，作为阴性对照。阴性对 照不得有菌生长。（思考：设立阴性对 照的作用是什么？在无菌检查中能否不 设阴性对照？）
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第二节、无菌检查的基本原则与方法
药品
各类培养基
培养箱
无菌 操作
适温培养
各类针剂 输液等
厌氧、需 氧、霉菌
细菌：35℃ 霉菌：23-28℃
3．接供试品 将每组其中的1管分别接入规定量的 供试品作为供试品组，另1管作为阳性对照（组）。
• 第一节 概述 • 第二节、无菌检查的基本原则与方法 • 第三节 无菌检查培养基的适用性检查 • 第四节 无菌检查方法学的验证试验 • 第五节 直接接种检查技术 • 第六节 薄膜过滤法检查技术 • 第七节 无菌检查各种中和(灭活)剂的作
用机理
第一节 概述
一、无菌检查法的概念与基本要求 无菌检查法系用于确定要求无菌的药品、医疗器
三、药品的无菌检查
授课人:汪穗福(高级讲师) 苏惠虹(助理讲师)
广州市医药中专学校 2005年3月
教学 目标
1．熟知无菌检查的方法学验证 2．熟知无菌检查供试品溶液、培养基和缓
冲液的制备和结果判断。 3．掌握影响无菌检验的因素和解决办法。 4.了解无菌检查的基本原则与方法。
教学重点: 无菌检查供试品溶液、培养基和缓冲液
具、原料、辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的 一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内或隔离系统中（图6－1） 进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物 污染。单向流空气区、工作台面及环境必须定期按国 家标准GB/T16292～16294–1996《医药工业洁净室(区) 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行洁净度 验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境 的洁净度须符合无菌检查。
（二）检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g 或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量 按表9－9、表9－10、表9－11规定。采用直接接种法 时，若每支（瓶）供试品的装量足够接种两份培养基， 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养 基。。采用薄膜过滤时，检验量应不少于直接接种的 供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤。
隔离系统
无菌检查用无菌室的要求
使用的培养基可按《中国药典》规定的处方制备， 也可使用符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证 合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～ 25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中， 一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 一年内使用。
硫乙醇酸盐流体培养基应置30～35℃培养；改良马 丁培养基置23～28℃培养，培养天数均为14 d。
表9-9:批出厂产品最低检验数量
批产量N（个） 每种培养基最少检验数量
注射剂
≤100
10%或4个（取较多者）
100＜N≤500
10个
＞500
2%或20个（取较少者）
大体积注射剂（＞100 ml） 2%或10个（取较少者）
眼用及其他非注射产品
≤200
5%或2个（取较多者）
＞200
10个
桶装固体原料 ≤4
每个容器
4＜N≤50
20%或4个容器（取较大者）
＞50
2%或10个容器（取较大者）
抗生素原料药（≥5g）
6个容器
医疗器具 ≤100
10件
100＜N≤500 10%或4件（取较多者）
＞500
2%或20件（取较少者）
注：若每个容器的 量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量应加倍。
表9-10：上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量
分两种方法
（一）直接接种法的验证试验
1．接种硫乙醇酸盐流体培养基管 取符合直接接种 法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，无 菌操作分别接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌到各2管中；
2．接种改良马丁培养基管 取符合直接接种法培养 基用量要求的改良马丁培养基4管，无菌操作分别接 入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。
的制备和结果判断
教学难点: 无菌检查的方法学验证
药品无菌标准是国家对药品生产的卫生法规。它对药 品生产企业、医院制剂部门的文明生产、现代化管理及 保证药品的卫生质量，保证人民的健康起着重要的促进 作用。因此凡用于确定要求无菌的药品、医疗器具、原 料、辅料及要求无菌的其他品种在出厂前均应进行无菌 检查，它是保证药物制剂质量的重要措施之一。
供试品装量M/ 每支样品接入每管培 最少检验数量
支或瓶
养基的最小样品量 （瓶或支）
M <50
全量
20 ①
50≤M<300
半量
10
300≤M<5g
150
10
M≥5g
500
10②
外科用敷料棉花及纱布 取100mg或1cm×3cm 10
缝合线、一次性医用材料 整个材料③
20①
带导管的一次性医疗器具(如输液袋)
第三节 无菌检查培养基的适用性检查
无菌性 检查
方法是:在配制好每批培养基后， 随机取不少于5支（瓶），培养 14 d，应无菌生长。该检查试
验可在供试品的无菌检查前或
适
与无菌检查同时进行。
用
性
检
是指证明无菌检查用的硫乙醇
查
灵敏
酸盐流体培养基及改良马丁培养
度
基等在进行药品无菌检查时，所
检查
加的菌种在培养基中的能正常生
(4)生孢梭菌（Ｃlostridium sporogenes） [CMCC(B)64941]；
（5）白色念珠菌（Ｃandida albicans） [CMCC(F)98001]，
（6）黑曲霉（Ａspergillus niger） [CMCC(F)98003]。
灵敏度检查所用的菌株的传代次数不得超过5代（从菌 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适 宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
（一）检查数量 检验数量是指一次实验所用供试品 最小包装的数量。除另有规定外，出厂产品按表9－9 规定，上市产品监督检验按表9－10表9－11规定。表 9－9、表9－10、表9－11中最少检验数量不包括阳性 对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检 查若采用薄膜过滤，应增加1/2的最小检验数量作阳 性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支 （或瓶）作阳性对照用。
供试品装量V
每支样品接入每
最少检验数量
（ml）
管培养基的最少样品量（ml） （瓶或支）
≤1
全量
20①
1＜V＜5
半量
10
5≤V＜20
2
10
20≤V＜50
5
10
50≤V＜100
10
10
50≤V＜100
半量
10
(静脉给药)
100≤V＜500
半量
6
V ≥500
500
6
1.每种培养基各接种10支供试品。
表9-11：上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量
稀释液、冲洗液应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明 其有效性，且对微生物生长及存活无影响。
无菌 检 查法
直接接种法 薄膜过滤法
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法。并且检查方法须经过 方法学验证，每一试验菌应逐一 进行验证。
三、无菌检查有关要求
进行无菌检查法时要对样品进行抽样，它是指从一 批产品中抽取一定数量的样品作为检验样本的方法。 无菌检查法建立在批产品受微生物污染是均一的假设 上，但是即使整批产品非常均匀，检出低水平污染的 几率也是很低的。因此，应尽量抽取批生产开始和结 束或生产过程出现异常情况下的产品进行检验。抽样 要采用随机抽样的方法原则进行，并应按以下要求进 行检查。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下 列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。
验证时，按“供试品的无菌检查” 的规定及下列要求进行操作。对每一 试验菌应逐一进行验证。其方法步骤 如下：
一、制备验证用菌种及菌液 具体 方法与操作同培养基灵敏度检查的菌 液制备。
二、验证方法试验 进行验证试验。
长良好，从而证实培养基灵敏度
符合规定，可用于无菌检查试验。
（一） 灵敏度检查用菌种
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]；
(2) 铜绿假单胞菌（Ｐseudomonas aeruginosa） [CMCC(B)10104]；
（3）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 〔CMCC(B) 63501〕，
黑曲霉新鲜培养物→改良 马丁琼脂斜面培养基， 20～25℃培养18～24 h；
加入3～5ml的0.9％无菌NaCL溶 液将孢子洗脱,吸出悬液至无菌 管内，用0.9％无菌NaCL溶液制 成小于100 cfu/ml的孢子悬液。
（三） 培养基接种
9支
硫乙 醇酸 盐流 体培 养基
12ml
5支
改良 马丁 培养 基
每天观察
澄清无混浊
报告
观察14天
混浊（
确证
镜检重
疑似情况） 新培养
合格
无菌 有菌
不合格
无菌检查 的概率 机理
系根据对整体中部分样品的检验结果，推断整体的 灭菌情况(无菌或染菌)，因此,涉及统计学的运用。
如一批药品中染菌者为10％，则抽取一份其染菌机率 P＝0.1,检出末染菌的机率ｑ＝1－p＝0.9。如抽取两 份样品，两份均末染菌的机率为P2＝0.01，两份均为 末染菌的机率ｑ2＝(1－P)2＝0.81。因此在一个无菌 检验中，若取n个样品时，ｎ个样品均为无菌的机率 ｑn＝(1-P)n。因此在少量染菌时，无菌试验不能检 验出来；相反如抽样数量增加时，则该批药品通过无 菌试验的机率愈小。为此取样及检查程序、方法必须 按照《中国药典》（2005年版）的规定进行。 返回
（四） 阳性对 照应根 据验证 试验结 果选择 阳性对 照菌
应符合接种的供试品体积不得大于培 养基体积的10％，
同时，硫乙醇酸盐每管不少于15ml， 改良马丁培养基不少于10ml。
培养基的用量和高度同方法验证试验； 培养基接种管数同供试品检验数量。
无抑菌作用及G＋菌的供试品，以金黄色 葡萄球菌为对照菌；抗G-菌为主的供试品 以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试 品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试 品，以白色念珠菌为对照菌。阳性用菌液 制备同培养基灵敏度检查,加菌量小于 100cfu。供试品用量同供试品无菌检查每 份培养基接种的样品量。见表9-10、表9-11。 阳性对照管培养48~72 h应生长良好。