食品SEMINAR论文

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食品学院B09107258 刘贺
摘要：蛋白质与脂肪酸间作用方式已用多种方法停止过实验。

除传统方法外，近年来在油脂界运用较多的结构X-衍射和NMR方法也为这个范围带来了庞大变化。

本文综述了迄今为止常用的研讨脂肪酸与蛋白质结合的方法并对一些最新停顿停止了剖析。

关键词：脂肪酸蛋白质FABPs
Abstract: The interactions of fatty acids with proteins have been studied by a variety of conventional approaches for decades. In addition to traditional methods, the application of techniques of structural biology such as X-ray crystal and NMR has brought about dramatic advances in this important area of lipid research. Keywords: fatty acid; protein; fatty acid-binding proteins
数十年以来脂肪酸与蛋白质间作用力均用各种传统方法停止研讨，且所失掉的有效信息较少。

近些年来，结构生物学方法如X-衍射和NMR法的运用对这一范围的油脂研讨带来了庞大变化。

几种蛋白质的高分辨率的X-衍射和NMR图谱提醒了蛋白质的完整三级结构以及其与脂肪酸的相互作用方式。

本文对目前常用的FABP检测方法如免疫检测法、X-衍射法、核磁共振(NMR)法及传统剖析方法等及其研讨停顿停止了综述。

文中所总结的结合脂肪酸的蛋白质有罕见的人血洁白蛋白和脂肪酸结合蛋白。

迄今为止已有至少17种脂肪结合蛋白被明白鉴定[1]，而其中至少10种都属于脂肪酸结合蛋白(FABP)[2]。

FABP是一族分子量为14~16kD的蛋白质，至少有9种类型：肝、小肠、心、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮等，经过亲和层析的方法可以从以上不同组织细胞取得相应的纯品。

这一族蛋白还包括细胞视黄醇结合蛋白Ⅰ和Ⅱ。

FABP在体内的含量丰厚，占细胞内可溶性蛋白总量的3~8%。

一切FABP的氨基酸系列有38~70%的等异性[3]。

组织损伤后，细胞蛋白质会从血浆中释放出来，关于局部缺血、再灌注、神经紊乱、癌症或器官排异等惹起的组织损伤，FABP可作为一种牢靠的生物标志蛋白。

不同亚型的FABP在评价脑损伤、骨骼肌损伤、肾脏损伤、肝脏损伤等的运用是最近研讨的热点，因此检测FABP，并了解脂肪酸与FABP间作用方式及作用特点具有重要的价值[4]。

1 免疫检测法
有关FABP定量检测的最早报道是Ockner等1974年在研讨I-FABP时采用的放射免疫法[5]。

在此测定方法中，Ockner等首先经过凝胶过滤柱层析及等电聚焦电
泳取得纯化的I-FABP，然后用纯化I-FABP免疫家兔以取得I-FABP抗血清并用14C 停止放射性标志。

14C标志抗血清与特测标本反响后，经过测定免疫沉淀中放射性比活度来植测相应I-FABP的浓度。

Ockner等报道的方法预备进程及测定进程都较为繁琐，价钱昂贵且存在放射性污染，但为FABP测定方法的改良奠定了基础。

1997年，Wodzig等[6]成功地开发了检测H-FABP的一步夹心ELISA法，与两步ELISA法的灵敏性和特异性基本相反。

2004年，Pelsers等人[7]应用亲和纯化重组人源化的抗B-HABP多克隆抗体开发了B-FABP检测的夹心ELISA法。

ELISA法是FABP定量测定的一个规范的方法。

2 X-衍射法
许多研讨者用不同方式来研讨脂肪酸与白蛋白间作用方式[8]。

1980年，Brown 依据氨基酸序列以及二硫键位置，并且思索了事先的生物物理及生物化学研讨，从而提出了白蛋白的详细三级结构[9]。

这个模型虽然较为美观但是推测性太大，在以X-衍射研讨脂肪酸与白蛋白间作用出现以前，少量的研讨结果只失掉一张关于白蛋白与脂肪酸作用的低分辨率的图片。

蛋白化学家与油脂学家都急切想了解白蛋白的详细三级结构。

为到达此目的，实验中遇到了许多阻碍，其中包括膜衍生白蛋白，即异源纯化及结晶均难度较大。

1994年，X-衍射用于研讨从人体血清纯化出的白蛋白结晶[10]，后来又将其运用于重组体蛋白质，从而第一次提供了这种重要蛋白质的准确图片。

这张高分辨率的结构展现出这种蛋白质总体呈心形而不是这位作者之前所说的〝圆柱形〞[11]。

其他研讨者也随后以X-衍射研讨了心形的脱脂蛋白质和与脂肪酸结合后的蛋白质(图1A)。

脱脂蛋白质有一个复杂的结晶结构；它没有Brown所说的较复杂且有三个圆柱的对称结构，脂肪酸如何结合进这种结构也没有任何证据。

目前最完整且分辨率较高的脂肪酸-白蛋白结合图是用X-衍射法失掉的人血洁白蛋白(HSA)和特异脂肪酸共结晶所失掉的[12]。

HSA与8分子肉豆蔻酸(C14:0)(图1B)提醒了蛋白质的主要结构要素以及脂肪酸-蛋白质相互作用结构。

蛋白质由三个域组成，而每个域又由两个亚域组成。

主要结构是螺旋结构，每个域中有10个螺旋结构，而亚域中有4或6个。

8个脂肪酸贯串于整个蛋白质结构中，且结合特点为：脂肪酸的羧基与侧链中碱性及极性氨基酸构成盐键或氢键，而脂肪酸链那么嵌入螺旋结构的疏水区域中。

脂肪酸的羧基处于水相中，当经过疏水通道时，长链脂肪酸几个结合位点的甲基也暴露在水相。

不含脂肪算的HSA结构(图1A)和C14:0/HSA复合物(图1B)表现出清楚的构象变化。

总体构象的庞大改动或许是结合多个配基后发生的结果，而这种现象在其他蛋白质中未发现。

另外，体外这种由配基惹起的白蛋白构象变化能否会影响脂肪酸向细胞内的运输仍是一个值得讨论的效果。

图1 X-衍射图谱
(A)脱脂HSA的主要结构(B)8个豆蔻酸配基的不同结合位点散布
显然，HSA的X-衍射结构代表了白蛋白研讨的一个严重提高，尤其在脂肪酸与其作用的研讨方面。

但是，X-衍射自身的局限性以及所失掉的各种类型的信息为以其他科技手腕继续停止研讨留下了空间。

对结晶结构最理想的补充就是溶液结构，这样除了可以提醒复杂的三级结构外也可提醒蛋白质的详细动力学特性。

3 核磁共振(NMR)法
FABP的早期研讨发现，FABP是高度水溶的，它的配基通常是脂肪酸，中性条件下普通不溶于水，而FABP族中有一些种类还会结合诸如胆汁酸之类的油脂[13]。

它的生物学研讨包括与脂肪酸的结合特点是用13C NMR法停止研讨的。

一些NMR的剖析得出结论：鼠肠道(I-)FABP仅结合一个脂肪酸，且脂肪酸的羧基与精氨酸残基相互作用[14]，这种预测随后被其详细三维结构所证明。

FABP通常较容易纯化和结晶从而用于X-衍射剖析，此外，其低分子量及较少的螺旋结构含量也使得它可用NMR停止结构研讨。

第一个被报道的FABP结构是鼠I-FABP的结晶结构[15]。

X-衍射的结构与人I-FABP的NMR结构相似水平较高。

一篇文章报道了11张NMR溶液结构图和28张FABP结晶结构图，均为高分辨率图，发现即使氨基酸序列同源性较低，甚至低于25%，但是一切FABP族成员均有相似的结构骨架，而这与血白蛋白完全不同。

FABPs相反的重要结构特征可以用人I-FABP溶液结构来提醒(图2)。

FABPs 的β-折叠结构含量较高，基本不含螺旋结构，只要少数例外，且不含二硫键(disulfide linkages)。

NMR所得FABP结构与X-衍射所得结构一样准确，但NMR还可提醒蛋白质的动力学或构象学变化。

例如，图2A中所展现的10个能量最小化结构说明了蛋白质终端和螺旋区域仍有很大的变化性。

一些辅佐的NMR实验，例如蛋白质骨架的弛豫时间测定可以提醒蛋白质各局部的动力学特性，并对配基如何进入和脱离蛋白质提供线索[16]。

I-FABP的带型图展现了10条逆平行的
β-strands构成了〝上-下〞型β-barrel。

β-barrel外部空间较大(~850Å3)其中的疏水和极性/带电残基数量基本相反。

图2 核磁共振(NMR)谱图
(A)DIANA计算出的骨架结构(B)模拟退火及能量最小化后计算所得彩带谱图
4 传统剖析方法[17]
虽然有许多方法运用于检测FA和FABPs间作用，但目前为止，一些传统的方法如Lipidex，ADIFAB法和ITC法还是运用最普遍的手腕。

4.1 Lipidex法(The Lipidex assay)
这种方法是由Glatz和V eerkamp所开展起来的，包括用hydroxyalkoxypropyl 衍生化处置过的疏水性Sephadex-G25(Lipidex 1000)在0℃下分别未结合FA。

此方法中，脱脂FABP在放射标志的FA缓冲液中平衡，然后参与Lipidex与未结合FA停止反响，将Lipidex/FA复合物离心除去，测定外表放射性即可知FABP上FA的结合量。

Dissociation常数是用Scatchard plot所计算的，同时可失掉总蛋白浓度以及未结合与结合FA的比率。

这种方法的效果之一是结合到Lipidex或FABP下面的FA分别进程较为缓慢，这是由于FA需求从后者转移到前者下面去。

因此，结合到FABP 下面的脂肪酸量就变得过低；而0℃下分别也招致结果不可信，由于dissociation 常数是随温度停止变化的。

由于这种方法并不是真正在平衡条件下停止，K d值通常被以为偏高，这种方法可以依据FABP或其配基类型失掉长链脂肪酸在mM级的亲和度。

但是这种方法可运用于低溶解度配基。

4.2 ADIFAB法(Acrylodan labeled intestinal fatty acid binding protein assay)
这种方法的出现防止了Lipidex方法的一些缺陷。

它是一种荧光方法，将小鼠肠FABP中α-螺旋Ⅰ的Lys27用荧光acrylodal停止标志，然后应用这种FABP经过荧光变化测定水溶液中未结合的游离FA。

ADIFAB是一种测量水溶液中未结合游
离脂肪酸的专利方法，较复杂，且一步即可完成。

它不只能提供结合常数，还能失掉热动力学参数及结合kinetics。

假设没有未结合游离脂肪酸，ADIFAB的探针荧光在432nm，激起波长为386nm。

当游离脂肪酸存在时，发射波长发作蓝移，505nm处峰随脂肪酸结合浓度相关。

505nm处和432nm处荧光强度之比可以准确表示脂肪酸结合才干。

4.3 等温滴定热量法( isothermal titration calorimetry)
此方法是由Miller和Cistola首先运用的，可测定FABP与脂肪酸间热量。

将脂肪酸滴定到含FABP的溶液中，为了维持样品温度所需热量即为实验的原数据。

剖析每次参与脂肪酸时所失掉的峰值，这些峰值对应热量的吸收与释放，也代表了表观结合焓。

不过此方法需求价钱昂贵的微型滴定热量计和较大的蛋白质计量器(quantities)。

4.4 高效亲和层析(high-performance affinity chromatography)
将固定蛋白质运用与色谱体系中研讨生物分子间作用被称为〝生物色谱〞或高效亲和色谱(HPAC)，这种方法可以同时定性定量测定可逆的水溶性蛋白结合状况。

HPAC应用了一种生物聚合体以共价或非共价的方式结合到高效液相色谱上，同时运用了高效液相色谱的实验技术。

这种技术中，目的蛋白固定在液相支柱上，而从固定相上失掉的色谱保管时间状况即可反响游离蛋白的结合特性。

一旦一种化合物已由色谱保管时间所确定，这种化合物即可作为确定另一种化合物结合才干的规范物。

这种方法十分灵敏、快速且准确。

但生物体系的极端复杂性限制了合理设计一个可以直接模拟给定生物体系的色谱体系。

另外，色谱学是一种可以提供许多准确、可反双数据的方法。

用这种方法，经过对几种蛋白质的研讨即可了解结合特点。

Massolini将鸡肝FABP结合到氨丙基硅胶上作为固相，检测蛋白的对应选择性，而为了提醒FA的保管机制，他还停止了竞争性实验：以其它脂肪酸为竞争性配基观察其结合状况。

5 结论
30年来有1000多篇关于脂肪酸和蛋白质三维结构、脂肪酸结合特性的论文曾被宣布，但其中〝微妙〞仍未被完全发现。

本文对研讨脂肪酸和蛋白质间作用力的各种方法停止了综述，希望所述几种方法的独自或结合运用可以对进一步提醒两者间作用方式有积极作用。

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