病毒的鸡胚培养法接种途径
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医学微生物学实验
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
类酵母型菌落（yeast-like colony）
丝状型菌落（filamentous colony）
新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、 较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑， 与一般细菌菌落相似 . 白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、 较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培 养基内.
5 、观察：注射完毕，将用过的注射器放入煮
沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设 备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。
接种3~4天后小白鼠出现耸毛，活动减少或增 强，表现出如震颤，绕圈，蜷曲，尾强直或麻 痹，直至瘫痪死亡。一般在濒死前解剖去脑组 织传代及做病毒鉴定。 （本次实验不做饲养，接种完成可立即处死小 白鼠，剪开头部皮肤，打开颅腔观察锥蓝染液 的分布，确定穿刺接种是否正确）
表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培
养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒 毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，呈草绿色， 且培养基常有皱裂。
小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌
落为棉絮状、羊毛状或粉末状。
实验报告
抗酸染色
简述抗酸染色原理、方法和结果。
绘制抗酸染色油镜下观察图。
4 接种：去除卵膜，用注射器抽取病毒悬液
0.2ml,于绒毛尿囊膜上滴上病毒悬液0.1~0.2ml。
5 封口：用胶布封闭两口，胶布事先用碘酒消
毒，并通过火焰烧去余碘。
6 培养：放入37℃温箱培育4天 7 收获：在人工气室周围用碘酒消毒，用无菌
镊子扩大卵窗，轻轻夹起绒毛尿囊膜，并用无 菌小剪刀沿人工气室周围将绒毛尿囊膜剪下， 放置于加有生理盐水的无菌平皿中观察。
卵窗
约1cm的等边三角形
2 取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒记号处，用锯
片将标记三角区卵壳锯穿，（注意勿损伤卵壳下 各层膜组织），取下所画三角形区域的卵壳， （注意卵壳下各层膜组织），然后用针尖轻轻将 暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及绒毛尿 囊膜）。
3 造人工气室：在自然气室部分消毒后用锥子
或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自 气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下 陷形成一“人工气室”。
真菌菌落的观察（示教）
真菌培养营养要求不高，在一般培养基 上能生长 常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含 4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂、 pH4.0~6.0），真菌的最适酸碱度是 pH4.0~6.0，最适生长温度浅部真菌 22~28℃，深部真菌37℃ 。
真菌菌落类型
酵母型菌落（yeast colony）
六、注意事项
1、无菌操作ຫໍສະໝຸດ 2、染色时间要充分3、初染时加热的温度，勿沸腾，干涸
病毒的培养 真菌菌落形态观察
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
实验目的
了解病毒的培养方法 了解病毒的鸡胚接种及动物接种方法 了解常见真菌的菌落特点
羊膜腔
鸡 胚
卵黄囊 尿囊腔 卵 白
鸡胚结构示意图
卵膜
2 病毒的鸡胚培养法
目的 了解病毒的鸡胚培养法 材料 9~12日龄鸡胚，病毒悬液，无菌1ml 注射器，锯片，锥子，小镊子，橡皮头 ，小烧杯等
判断鸡胚是否存活
眼点，胚胎活动度，大血管等
绒毛尿囊膜接种法(2人/鸡胚)
1 定位：将在检卵灯下
将胚胎部分及自然气室部 分用记号笔画出，在离开 胎盘与大血管区画一直径
方法 1 、取 病 毒 悬液 ： 用 1ml 注 射 器取 0.1ml 毒 悬液，去除 注射器内的 气泡。
2、抓取小白 鼠（如图）
左手拇指和食指握住小白鼠头部，左手手掌轻轻按住小白鼠体部固定在操作台上。
3 、消毒注射部位：右手用棉签蘸以碘酒，消
毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。
4 、接种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与 耳根联线的中点略偏耳朵的方向）穿刺，进入 颅腔即可，（一般进针 2 － 3mm ）不要插得太 深，注射量0.02~0.03ml。
抗酸染色
Acid fast stain 一、实验目的
1、掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义
2、熟悉抗酸染色的原理。
二、实验原理
分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分 枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌 一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促 使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合 后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与 石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处 理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌 仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。
2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。
3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸 吸干。
五、实验结果
初染
石 炭 酸 复 红
脱色
盐 酸 酒 精
复染
碱 性 美 兰
未染色
初染后
脱色后
复染后
结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝 状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。
三、实验材料
细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美 兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等
四、方法与步骤（与革兰染色的差别）
1、细菌涂片的制备
涂片 干燥 固定
2、染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴， 在火焰高处（2~10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸 汽即暂时离开，加热3~5min，若染液蒸发减少，应再 加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。
处死小白鼠-颈椎脱臼法
2 病毒的鸡胚培养法
接种途径
尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 绒毛尿囊膜接种法 羊膜囊接种法
适用于流感病毒，痘类病毒，疱疹病毒，脑 炎病毒等的培养，可根据病毒种类选择适宜 接种部位，如分离流感病毒常用羊膜腔和尿 囊腔同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊 膜接种法
绒毛尿 囊 卵膜 膜 气 室
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
类酵母型菌落（yeast-like colony）
丝状型菌落（filamentous colony）
新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、 较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑， 与一般细菌菌落相似 . 白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、 较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培 养基内.
5 、观察：注射完毕，将用过的注射器放入煮
沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设 备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。
接种3~4天后小白鼠出现耸毛，活动减少或增 强，表现出如震颤，绕圈，蜷曲，尾强直或麻 痹，直至瘫痪死亡。一般在濒死前解剖去脑组 织传代及做病毒鉴定。 （本次实验不做饲养，接种完成可立即处死小 白鼠，剪开头部皮肤，打开颅腔观察锥蓝染液 的分布，确定穿刺接种是否正确）
表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培
养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒 毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，呈草绿色， 且培养基常有皱裂。
小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌
落为棉絮状、羊毛状或粉末状。
实验报告
抗酸染色
简述抗酸染色原理、方法和结果。
绘制抗酸染色油镜下观察图。
4 接种：去除卵膜，用注射器抽取病毒悬液
0.2ml,于绒毛尿囊膜上滴上病毒悬液0.1~0.2ml。
5 封口：用胶布封闭两口，胶布事先用碘酒消
毒，并通过火焰烧去余碘。
6 培养：放入37℃温箱培育4天 7 收获：在人工气室周围用碘酒消毒，用无菌
镊子扩大卵窗，轻轻夹起绒毛尿囊膜，并用无 菌小剪刀沿人工气室周围将绒毛尿囊膜剪下， 放置于加有生理盐水的无菌平皿中观察。
卵窗
约1cm的等边三角形
2 取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒记号处，用锯
片将标记三角区卵壳锯穿，（注意勿损伤卵壳下 各层膜组织），取下所画三角形区域的卵壳， （注意卵壳下各层膜组织），然后用针尖轻轻将 暴露的卵膜中心刺破一个小口（不要伤及绒毛尿 囊膜）。
3 造人工气室：在自然气室部分消毒后用锥子
或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自 气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下 陷形成一“人工气室”。
真菌菌落的观察（示教）
真菌培养营养要求不高，在一般培养基 上能生长 常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含 4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂、 pH4.0~6.0），真菌的最适酸碱度是 pH4.0~6.0，最适生长温度浅部真菌 22~28℃，深部真菌37℃ 。
真菌菌落类型
酵母型菌落（yeast colony）
六、注意事项
1、无菌操作ຫໍສະໝຸດ 2、染色时间要充分3、初染时加热的温度，勿沸腾，干涸
病毒的培养 真菌菌落形态观察
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
实验目的
了解病毒的培养方法 了解病毒的鸡胚接种及动物接种方法 了解常见真菌的菌落特点
羊膜腔
鸡 胚
卵黄囊 尿囊腔 卵 白
鸡胚结构示意图
卵膜
2 病毒的鸡胚培养法
目的 了解病毒的鸡胚培养法 材料 9~12日龄鸡胚，病毒悬液，无菌1ml 注射器，锯片，锥子，小镊子，橡皮头 ，小烧杯等
判断鸡胚是否存活
眼点，胚胎活动度，大血管等
绒毛尿囊膜接种法(2人/鸡胚)
1 定位：将在检卵灯下
将胚胎部分及自然气室部 分用记号笔画出，在离开 胎盘与大血管区画一直径
方法 1 、取 病 毒 悬液 ： 用 1ml 注 射 器取 0.1ml 毒 悬液，去除 注射器内的 气泡。
2、抓取小白 鼠（如图）
左手拇指和食指握住小白鼠头部，左手手掌轻轻按住小白鼠体部固定在操作台上。
3 、消毒注射部位：右手用棉签蘸以碘酒，消
毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。
4 、接种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与 耳根联线的中点略偏耳朵的方向）穿刺，进入 颅腔即可，（一般进针 2 － 3mm ）不要插得太 深，注射量0.02~0.03ml。
抗酸染色
Acid fast stain 一、实验目的
1、掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义
2、熟悉抗酸染色的原理。
二、实验原理
分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分 枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌 一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促 使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合 后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与 石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处 理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌 仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。
2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。
3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸 吸干。
五、实验结果
初染
石 炭 酸 复 红
脱色
盐 酸 酒 精
复染
碱 性 美 兰
未染色
初染后
脱色后
复染后
结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝 状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。
三、实验材料
细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美 兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等
四、方法与步骤（与革兰染色的差别）
1、细菌涂片的制备
涂片 干燥 固定
2、染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴， 在火焰高处（2~10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸 汽即暂时离开，加热3~5min，若染液蒸发减少，应再 加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。
处死小白鼠-颈椎脱臼法
2 病毒的鸡胚培养法
接种途径
尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 绒毛尿囊膜接种法 羊膜囊接种法
适用于流感病毒，痘类病毒，疱疹病毒，脑 炎病毒等的培养，可根据病毒种类选择适宜 接种部位，如分离流感病毒常用羊膜腔和尿 囊腔同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊 膜接种法
绒毛尿 囊 卵膜 膜 气 室