HPLC_ELSD法测定通窍鼻炎片中黄芪甲苷的含量_王中男

HPLC －ELSD 法测定通窍鼻炎片中黄芪甲苷的含量
王中男
1，2
（1.吉林敖东药业集团股份有限公司博士后工作站，吉林敦化133700；2.长春中医药大学，吉林长春130117）摘要：目的：建立测定通窍鼻炎片中黄芪甲苷含量的方法。

方法：采用高效液相色谱法－蒸发光散射检测器
（HPLC －ELSD ）法。

色谱柱为AgiLent TC －C 18柱，流动相为乙腈－水（31ʒ69），柱温为25ħ，流速为1.0mL /min ，进样量为10μL ；ELSD 检测器漂移管温度为40ħ；氮气流速为2．0mL /min 。

结果：黄芪甲苷进样量在0．03896 0．7792mg 范围
内呈良好线性（r =0．9995）；加样回收率为99．62%，RSD =1．13%（n =9）。

结论：本方法操作简便、准确、灵敏度高、重复性好，
可作为通窍鼻炎片的质量控制方法。

关键词：通窍鼻炎片；黄芪甲苷；HPLC －ELSD ；含量
中图分类号：R284．1
文献标识码：B
文章编号：1000－1719（2012）08－1441－03
Determination of Astragaloside Content in Tongqiao Biyan Tablets by HPLC －ELSD
WANG Zhong-nan 1，
2
（1.Jilin Aodong Pharmaceutical Group Company Limited of Postdoctoral Workstation ，Dunhua 133700，Jilin ，China ；
2.Changchun University of Chinese Medicine ，Changchun 130117，Jilin ，China ）
Abstract ：Objective ：To establish the method for the content determination of astragaloside in Tongqiao Biyan tablets．Meth-ods ：HPLC －ELSD method was adopted．The determination was performed on Agilent TC －C 18column with mobile phase consis-ted of acetonitrile-water （31ʒ69）at the flow rate of 1．0mL ·min －1．The injection volume was 10μL and column temperature was 25ħ．The drift tube temperature was 40ħand the flow rate of carrier gas was 2．0mL ·min －1．Results ：The line arrange of astra-galoside was 0．03896 0．7792μg （r =0．9995）．Average recoveries were was 99．62%（RSD =1．13%，n =9）．Conclusion ：The method is simple and accurate ，and has good sensitivity and reproducibility．It could be used for quality control of Tongqiao Biyan tablets．
Key words ：Tongqiao Biyan tablets ；Astragaloside ；HPLC －ELSD ；content
收稿日期：2012－04－16
作者简介：王中男（1958－），男，吉林长春人，教授，博士研究生导师，博
士后，从事中医内科学研究。

通窍鼻炎片为现代中药复方制剂，药物组成有炒
苍耳子、防风、黄芪、白芷等组成，具有散风固表、宣肺通窍的作用。

用于风热蕴肺、表虚不固所致的鼻塞时
轻时重、
鼻流清涕或浊涕、前额头痛；慢性鼻炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎见上述证候者。

本实验对通窍鼻炎片的
质量标准做了提高，为进一步控制本品质量打下基础。

按照《药品注册管理办法》及国家药品审评中心关于中药复方制剂质量标准研究的具体要求，建立中药复方中主药的含量测定方法。

处方炒苍耳子为君药，防风、黄芪为臣药，白芷为佐药。

因《中国药典》中炒苍耳子、防风均没有收入含量测定方法，故选择方中的黄
芪作为含量测定药材，
黄芪甲苷为其主要成分，因此，本标准建立了黄芪中黄芪甲苷的含量测定［1］。

ELSD
近年在色谱方面的应用已越来越多，特别对无紫外吸收或紫外末端吸收物质具有较高的检测灵敏度。

为了
有效控制通窍鼻炎片的质量，
笔者建立了HPLC －ELSD 法测定通窍鼻炎片中黄芪甲苷含量的方法，此
法简便、高效、准确、重复性好，可有效控制通窍鼻炎片的质量。

1仪器与试药
日本岛津高效液相色谱仪（LC －2010AT ），蒸发光
散射检测器，
浙江大学N2000色谱数据工作站，BP211D 电子天平（德国赛多利斯有限公司），黄芪甲苷对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：
110781－200613），通窍鼻炎片样品（由吉林敖东药业提供，批号：20100601，20100602，20100603），阴性样品
自制。

乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯等。

2方法与结果［2］
2.1
色谱条件
色谱柱为Agilent TC －C 18柱，
流动相为乙腈－水（31ʒ69），柱温为25ħ，流速为1.0mL /min ，进样量为10μL ；ELSD 检测器漂移管温度为40ħ；氮气流速为
2.0mL /min 。

2.2溶液的制备
2.2.1
对照品溶液的制备
精密称取黄芪甲苷对照
品约4mg ，置100mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至
刻度，制成每1mL 含0.04mg 的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取本品20片，研细，精密称定4.5g ，置索氏提取器中，加甲醇40mL ，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4h ，提取液回收溶剂并浓缩
至干，残渣加水10mL ，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL ，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL ，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5mL 使溶解，放冷，通过D101大孔树脂柱（内径为1.5cm ，柱高12cm ），以水50mL 洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30mL 洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备
取不含黄芪药材的处
方其他药材，按照相同工艺制得阴性对照样品，再按
“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3
系统适用性与专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对
照品溶液各10μL ，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项
下色谱条件测定，色谱见图1。

理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不得低于4000。

2.3.1流动相的考察参考中国药典2010年版一部黄芪项下黄芪甲苷的含量测定方法中的流动相乙腈－水（32ʒ68）测定，结果分离效果不好，调整流动相比例乙腈－水（31：69），结果分离效果很好，故流动相采用该比例进行测定，并列入正文。

2.3.2系统适用性实验的考察
依上述方法，测得黄
芪甲苷对照品、
供试品、阴性对照品色谱图（见图1），计算其理论塔板数为4526.7521，该色谱条件下，样品
可得到较好的分离，故规定理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

A.黄芪甲苷对照品
B.供试品C 阴性对照品
图1
高效液相色谱图
2.4线性关系的考察精密吸取0.0389mg ·mL
－1
黄芪甲苷对照品1、
2、5、10、15、20μL 进样，按“2.1”项下色谱条件测定。

以
进样量的常用对数值（X ）对峰面积的常用对数值（Y ）进行线性回归，回归方程为y =207170x －28887，r =0.9995。

结果表明，黄芪甲苷浓度在0.03896 0.7792μg 范围内，线性关系良好（见表1、图2）。

表1
黄芪甲苷线性关系考察
进样量（μL ）
峰面积积分值1207856.2662399532.1565960630.000102068574.625153003094.25020
4167016.
500
图2
黄芪甲苷线性关系
2.5
精密度试验
精密吸取黄芪甲苷对照品10μL ，按“2.1”项下色
谱条件连续进样5次。

结果见表2。

表2
精密度考察
序号峰面积积分值11960186.12521986783.250珋x =1960576.77531939116.500RSD =1.24%
41933669.3755
1983128.625
2.6稳定性试验
取同一供试品溶液10μL ，分别于0、
4、8、12、24h 进样，按“2.1”项下色谱条件测定。

结果，峰面积的平均值为1978354.775，RSD =1.36%（n =5），表明供
试品溶液在12h 内稳定。

2.7
重现性试验
依法分别取同一批次样品5份，按“2.2.2”项下
方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定含量。

结果见表3。

表3
重现性考察
序号含量（mg /g ）10.189420.1873珋x =0.187530.1855RSD =0.83%
40.18865
0.1866
2.8
加样回收率试验
精密称取已知含量（0.1875mg /g ）的样品9份，
分别加入按“2.2.1”项下方法制备的对照品溶液，再按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定。

结果见表4。

表4黄芪甲苷加标回收率试验结果
序号取样量
（g）
加标量
（mg）
测得量
（mg）
回收率
（%）
平均回收率
（%）
RSD
（%）
1 2.2510.4130.821699.88
2 2.24960.4130.8223100.13
3 2.25060.4130.810497.10
4 2.24930.4140.821199.84
5 2.25090.4140.8266101.1499.62 1.13
6 2.24980.4140.8219100.02
7 2.24930.4150.816598.69
8 2.24910.4150.8219100.05
9 2.25080.4150.820999.72
2.9样品含量测定
分别取3批样品（批号分别为20100601，20100602，20100603）按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μL注入
收稿日期：2012－02－26
基金项目：国家自然科学基金委员会资助项目（81072743）
作者简介：董秀（1976－），女，辽宁沈阳人，讲师，研究方向：抗肿瘤活性化合物的筛选及其抗肿瘤作用及机理。

通讯作者：李建春（1950－），男，辽宁阜新人，教授，研究方向：中药及其天然产物抗炎、抗肿瘤研究，E-mail：jianchunli@yahoo．cn。

高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定含量，以外标两点法对数方程计算，结果见表5。

表5样品测定结果
批号含量（mg/g）RSD（%）
201006010.075 1.03
201006020.079 1.05
201006030.074 1.03
3讨论
本文参考中国药典2010年版一部黄芪项下黄芪甲苷的含量测定方法中的流动相乙腈－水（32：68）测定，结果分离效果不好，调整流动相比例乙腈－水（31ʒ69），结果分离效果很好，故流动相采用该比例进行测定，并列入正文。

由于TLC法操作烦琐，且误差相对较大，而黄芪甲苷的紫外吸收为末端吸收，干扰大，灵敏度低，也不适宜用HPLC紫外检测法，因此本文采用了HPLC－ELSD法测定黄芪甲苷的含量。

本实验建立的HPLC－ELSD方法准确、可靠，能满足样品中黄芪甲苷含量测定的要求。

参考文献
［1］国家药典委员会．中国药典2010年版（1部）［S］．北京：中国医药科技出版社，2010．
［2］王红霞，王蕾．HPLC－ELSD法测定利肝隆颗粒中黄芪甲苷的含量［J］．中国药房，2011，22（44）：4208－4209．
·论著臻新·
厚朴酚调控人小细胞肺癌H446细胞凋亡的机制研究
董秀1，2，于丹2，王淳2，王晓波2，王梅2，李建春1
（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳110016；2.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032）
摘要：目的：探讨厚朴酚对人小细胞肺癌H446细胞增殖和凋亡的影响。

方法：体外培养人小细胞肺癌H446细胞，经不同浓度和不同时间的厚朴酚作用后，应用MTT法检测厚朴酚对H446细胞增殖的影响；采用流式细胞仪罗丹明123染色法检测线粒体膜电位的改变；蛋白印迹方法检测凋亡相关蛋白的表达。

结果：厚朴酚可呈时间剂量依赖性抑制H446细胞增殖，诱导线粒体膜电位的下降，免疫印迹结果显示Bcl－2的表达降低，Bax、Cyto．c和活化pro－caspase9的表达增加。

结论：厚朴酚可显著抑制H446细胞增殖，介导线粒体途径的细胞凋亡。

关键词：厚朴酚；小细胞肺癌；细胞凋亡
中图分类号：R734．2文献标识码：A文章编号：1000－1719（2012）08－1443－03
Study on the Mechanism of H446Cells Apoptosis of Magnolol-Induced
Human Small Cell Lung Cancer
DONG Xiu1，2，YU Dan2，WANG Chun2，WANG Xiao-bo2，WANG Mei2，LI Jian-chun1
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，Liaoning，China；
2.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine，Shenyang110032，Liaoning，China）
Abstract：Objective：To study effects of magnolol on cell proliferation and apoptosis in human small cell lung cancer H446 cells in vitro．Methods：H446cel1s were cultured with magnolol in different concentrations and for different periods in vitro．Cell growth inhibition was measured by MTT assay．The mitochondrial membrane potential was detected by flowcytometric analysis of Rhodamin123staining．Protein expression was detected by Westem blot assay．Results：Magnolol induced cell growth inhibition in
a time-and dose-dependent manner．Compared with control group，magnolol-induced mitochondrial membrane potential collapse
decreased the protein expression of Bc1－2and increased the protein expressions of Bax，Cyto．c and pro-caspase9．Conclusion：。