补肾调肝方抗卵巢衰老的作用机制的研究

补肾调肝方抗卵巢衰老的作用机制的研究
陈玉梅;余志惠;黄桂花;沈维增;钟琳;姜焕好
【摘要】目的探讨大鼠卵巢自初始发育至衰老过程中卵巢颗粒细胞及其细胞因子的变化规律及补肾调肝方药干预影响,以期为补肾调肝方药抗卵巢衰老的作用机制
研究提供理论依据.方法分别选取3月、6月、12月、18月、24月龄Wistar大
鼠模拟其青春前期、青春期、性成熟期、近绝经期、老年期的生长发育过程;各月
龄大鼠均设立干预组和对照组,干预组以补肾调肝方灌胃干预20 ml/(kg·d),对照组灌以同等剂量的无菌饮用水.以常规TUNEL染色法观察各组大鼠卵巢颗粒细胞状态,计算凋亡指数(AI);并以RT-PCR对颗粒细胞促凋亡因子Bax及凋亡抑制因子Bcl-2 的mRNA表达进行半定量分析.通过各月龄组之间的对比观察卵巢颗粒细胞及其细胞因子的变化规律,并通过干预组和对照组之间的对比对补肾调肝方药抗卵巢衰老
的相关机制做相应探讨.结果 AI:对照组3、6、12月龄大鼠的AI均处于较低,18、24月龄大鼠AI均显著升高(P<0.05);与对照组相比,研究组大鼠各月龄AI均显著降低(P<0.05).Bax:对照组3、6、12月龄大鼠的Bax mRNA表达处于较低水平,18、24月龄显著升高(P<0.05);与对照组相比,干预组各月龄大鼠Bax mRNA表达均显
著降低(P<0.05).Bcl-2:对照组3、6、12月龄大鼠Bcl-2 mRNA表达处于较高水平,18、24月龄显著降低(P<0.05);与对照组相比,干预组各月龄大鼠Bcl-2 mRNA
表达均显著升高(P<0.05).结论凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA低表达及促凋亡因子Bax mRNA高表达所启动的颗粒细胞调亡过程可能为卵巢衰老的重要机制之一;补肾调肝方药可通过上调Bcl-2 mRNA表达与下调Bax mRNA表达抑制卵巢颗粒细胞的调亡,可能为其抗卵巢衰老的作用机制之一.
【期刊名称】《中国实用医药》
【年(卷),期】2013(008)016
【总页数】3页(P14-16)
【关键词】补肾调肝方药;抗卵巢衰老;作用机制;卵巢颗粒细胞;Bax;Bcl-2
【作者】陈玉梅;余志惠;黄桂花;沈维增;钟琳;姜焕好
【作者单位】518108,深圳市宝安区人民医院;518108,深圳市宝安区人民医
院;518108,深圳市宝安区人民医院;518108,深圳市宝安区人民医院;518108,深圳市宝安区人民医院;518108,深圳市宝安区人民医院
【正文语种】中文
围绝经期综合征是基于卵巢衰老而引发的一系列生理、心理病理性改变，临床以情绪调节障碍及生理机能渐行性衰退为主要表现［1］。

中医理论认为“肾藏精，主生殖”，肾阳充盛为女性生殖内分泌系统的物质基础。

现代研究表明，卵巢衰老是一个多重环节参与的渐进过程，受神经内分泌系统和生殖内分泌系统的双重调节。

卵巢萎缩，雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、孕酮(pregnendione，P)等雌激素分泌减少是卵巢衰老的早期信号［2，3］;同时，卵巢颗粒细胞凋亡信号广泛性激活，导致卵泡闭锁。

本研究以“卵巢颗粒细胞及其细胞因子的变化规律”为主线，观察补肾调肝类方药对卵巢衰老的调节作用，以期为其抗卵巢衰老机制的完善提供理论依据。

1 资料与方法
1.1 动物和分组本实验纳入3、6、12、18、24月龄健康Wistar大鼠共计120只，以其月龄为分组标准，分为5组，每组24只;在此标准下，各组大鼠随机分为对照组和干预组各12只，共计10组。

1.2 仪器和器材切片机(德国Leica公司，LeicaRM2135);电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂，SY11 Wi);光学显微镜(日本 Olympus公司，BX43);低温超速离心机(Beckman，AJ-30I);Mastercycler pro梯度PCR仪(eppendorf，Mastercycler pro);微量电动组织匀装器(北京优尼康生物科技有限公司);核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司，Biophotometerplus);凝胶成像分析仪(上海复日科技有限公司，FR-980)等。

1.3 主要试剂 TUNEL试剂盒(天津颧洋生物技术有限公司);总RNA提取试剂盒提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，NEP019-1);Oligod(T)1 8 primers(TaKaRa公司，D511);M-MLV RT(Promega公司，
M1701);Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa公司，D2313A);10 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，D4030RA);2.5 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，
D4030A);rTaq(含 6Xloading buffer、10XPCRbuffer)(TaKaRa公司，DRIOOA);DL2000 marker(TaKaRa公司，D501A);DEPC(Sigma公司);琼脂糖(BIOWEST，91622);DNAgreenMarker(北京天恩泽，70303);其他常用试剂如氯仿、无水乙醇、氯化钠等均为国产分析纯。

1.4 研究方法
1.4.1 给药及取材方法干预组以补肾调肝方灌胃干预20 ml/(kg·d)，对照组灌以同等剂量的无菌饮用水;干预15 d，处死取卵巢;各组均选取6例样品浸入4%多聚甲醛液固定，行TUNEL染色;剩余 6例余-70℃超低温冰箱储存，行RT-RCR。

1.4.2 TUNEL染色和凋亡指数(AI)计算方法 TUNEL染色严格按照试剂盒说明书流程进行，封片后以电镜观察卵巢颗粒细胞形态。

高倍视野下棕黄色颗粒即为卵巢颗粒细胞，采用Metamorph图像分析系统分析图像;随机选取5～7个视野，以凋亡颗粒细胞占颗粒细胞总数的百分比为AI。

1.4.3 RT-PCR方法以总RNA提取试剂盒提取卵巢组织mRNA，在
Mastercycler pro梯度PCR仪中自动完成常规反转录过程;所得产物以核酸蛋白分析仪测定浓度，作为模板DNA进行扩增。

各基因引物序列见表1。

扩增后所得产物为目的mRNA，进行2%琼脂糖凝胶(内含DNA Green 4 μl/100 ml)电泳，稳压100 V，电泳30-40 min，凝胶成像分析仪观察，计算相对光度值。

表1 引物序列Primer names F/R sequences Bax F 5'-CGAGTGTCTCCGGCCAAEEG-3'R 5'-ATGGEGAGCGAGGCGGTGAG-3'Bcl-2 F 5'-GGEACCGGAGAGCGTTCAGT-3'R 5'-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-
3'GAPDF F 5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'R 5'-GCCAGTAGAGGCAGCCATGATGTTC-3'
2 结果
2.1 AI 对照组3、6、12月龄大鼠的AI均处于较低，18、24月龄大鼠AI均显著
升高(P＜0.05);与对照组相比，研究组大鼠各月龄AI均显著降低(P＜0.05)。

见表2。

2.2 Bax 对照组3、6、12月龄大鼠的Bax mRNA表达处于较低水平，18、24月龄显著升高(P＜0.05);与对照组相比，干预组各月龄大鼠Bax mRNA表达均显著
降低(P＜0.05)。

见表3。

2.3 Bcl-2 对照组3、6、12月龄大鼠Bcl-2 mRNA表达处于较高水平，18、24
月龄显著降低(P＜0.05);与对照组相比，干预组各月龄大鼠Bcl-2 mRNA表达均显著升高(P＜0.05)。

见表4。

表2 各组大鼠AI比较(x ± s，%)注:与对照组相比，*P＜0.05;与前三个组相比，
▲P＜0.05组别 3个月 6个月 12个月 18个月 24个月对照组 10.3±1.3
11.3±1.2 10.9±1.4 72.2±21.4 69.3±22.6干预组7.2±0.4* 7.1±0.6* 6.9±0.4* 33.1±11.2＊▲ 31.2±12.1＊▲
表3 各组大鼠Bax mRNA表达比较(±s)组别 3个月 6个月 12个月 18个月 24
个月对照组0.321±0.022 0.337±0.018 0.341±0.016 0.884±0.092
0.741±0.063干预组0.201±0.017* 0.221±0.019* 0.224±0.015*
0.451±0.055▲ 0.446±0.027＊▲
表4 各组大鼠Bcl-2 mRNA表达比较(±s)组别 3个月 6个月 12个月 18个月 24个月对照组0.612±0.021 0.622±0.032 0.635±0.031 0.224±0.021
0.239±0.015干预组0.826±0.033* 0.794±0.035* 0.815±0.034*
0.514±0.049▲ 0.507±0.041＊▲
3 讨论
围绝经期综合征以情志障碍和内分泌紊乱为临床两大病理表现，其主要始动因素为卵巢衰退、雌激素水平低下所致卵泡闭锁。

颗粒细胞与卵母细胞、及内膜细胞共同构成卵泡的体细胞。

研究表明，颗粒细胞主司卵母细胞的营养供应及信号传导，在卵母细胞的生长、分裂和增殖过程中具有的调控重要作用;同时，也是促进卵泡生长发育的主要物质，其凋亡指数AI可间接衡量卵泡的发育状态。

Bax与Bcl-2是近年研究较为广泛的两类凋亡因子［4］，广泛存在于胚胎、淋巴、及部分肿瘤组织中。

其中Bax可促进凋亡信号的过表达，因而又称促凋亡因子;而Bcl-2基于己身对细胞凋亡过程的显著抑制效应，又称为凋亡抑制因子。

本课题组补肾调肝方是以中医基础理论为基础，结合临床实践而研制的经验方。

方中合用菟丝子、川断、蛤蚧以滋阴、温肾、助阳，可稳内分泌;合用白芍、远志以柔肝、宁心可平情志。

本研究从现代生物分子学水平上表明，Bcl-2 mRNA低表达及Bax mRNA高表达启动颗粒细胞的调亡过程可能为卵巢衰老的重要机制之一;而补肾调肝方药可显著上调Bcl-2 mRNA表达，同时下调Bax mRNA表达，延缓颗粒细胞的调亡过程，推测可能为其抗卵巢衰老的作用机制之一。

参考文献
［1］ Zhou B，Sun X，Zhang M，et al.The symptomatology of climacteric
syndrome:whether associated with the physical factors or psychological disorder in perimenopausal/postmenopausal patients with anxiety-depression disorder．Arch Gynecol Obstet，2012，285(5):1345-1352．［2］ Studd JW.A guide to the treatment of depression in women by estrogens．Climacteric，2011，14(6):637-642．
［3］ Graziottin A.Safety，efficacy and patient acceptability of the combined estrogen and progestin transdermal contraceptive patch:a review．Patient Prefer Adherence，2008，2(2):357-367．
［4］梁欣韫，牛建昭，杨美娟.育泡饮对自身免疫性POF小鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响．中华中医药学刊，2013，v.3101:21-23．。