重组结核分枝杆菌感染鉴别用变态反应原研究与应用

.述评.
重组结核分枝杆菌感染鉴别用变态反应原
研究与应用
徐苗王国治
自1890年科赫发明用于结核病免疫治疗的结 核菌素（tuberculin)，19〇7年奥地利人V.Pirquet将 结核菌素作为结核病诊断试剂以来[1]，产品也从滤 液蛋白粗提物改进为结核分枝杆菌纯蛋白衍生物 (purified protein derivative，PPD)，在结核菌素用于 结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test,TST )逾 百年后的今天，该类产品依然在结核病辅助诊断、流行病学调查，以及卡介苗接种阳转考核中发挥着巨 大作用。

随着结核病疫情的变化，早在2002年我国 研究者已经发现“靠单纯D O TS的现代结核病控制 策略，无法解决已经感染结核分枝杆菌人群发展为 结核病的潜在威胁，积极发现和治疗结核病与对已 感染结核分枝杆菌的高危人群实施预防是结核病控 制的根本”[2]。

而我国是结核高感染率与卡介苗高 接种率的国家，T S T对结核病患者、结核感染者及 卡介苗接种者均呈阳性，难以鉴别卡介苗接种与结 核感染，检测结果特异性欠佳。

因此，选择能有效区 分卡介苗与结核分枝杆菌的抗原，研制新一代结核 分枝杆菌变态反应原，用于筛查潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者成为研究热 点。

我国研究者从单一结核分枝杆菌早期分泌性靶 抗原6(ESAT-6)起步研究[3],经过近20年的努力，成功研制出结核分枝杆菌重组ESAT-6与培养滤液 蛋白10(CFP-10)融合蛋白变态反应原M。

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doi:10. 3969/j. issn. 1000-6621. 2020. 08. 003
基金项目：中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业 务（2019PT310024)
作者单位:100050北京，中国食品药品检定研究院生物制品检 定所中国医学科学院生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室
通信作者:王国治，E m ail: tbtestlab@ 126. com 2 〇20年由安徽智飞龙科马生物制药有限责任公司 上市，并由国家药典委员会确定中文通用名称为“重组结核杆菌融合蛋白（EC)”（简称“EC”），为实现 LTBI人群的筛选与预防提供了技术支撑。

EC-皮肤试验(EC-ST)用于LTB丨检测方法的建立
据W H O估计，目前全世界有1/3人口为LTBI 者。

通常情况下，90%的LT B I者终身保持健康，但 其余10%的L T B I者最终会发展成活动性结核病[5—6]。

因此，L T B I的筛选与预防，是终结结核病 的重点。

W H O对L T B I定义为：“一种由结核分枝 杆菌抗原刺激导致的持续免疫状态，但没有活动性 结核病的证据”，同时认为“检测L T B I没有金标 准”m。

鉴于L T B I无明确的临床证据，W H O推荐 的两种检测方法中，T S T与7-干扰素释放试验(interferon-7 release assays, IGRA)检测结果差异 存在统计学意义；即便是IGRA，不同类型试剂、同一类型不同厂家的试剂检测结果也不完全一致。

因此，对新型E C的诊断效果如何评价，便是一个实际 困难。

研究者充分考虑国内结核感染情况、卡介苗 接种情况及现有的对照试剂，主要基于对EC、与其 有相同用途的IGRA，以及T S T在不同人群中检测 结果的比较，并且对不同方法阳性检出率和结核分 枝杆菌不同感染程度的关联性进行分析，对E C开展临床评价。

一、E C作为LTBI检测试剂的可行性评估
依据EC、IG R A与T S T检测的基本原理，在临 床评价中提出以下总体评价思路与评价指标：(1)E C为结核特异性抗原，理论上EC-S T对确诊的 结核病患者应呈阳性反应，对卡介苗接种者应呈阴 性反应。

基于该原理，临床研究中如EC-S T在结核 病患者中的阳性反应率、在卡介苗接种者中的阴性 反应率符合理论预期，则提示健康人群中EC-S T皮肤试验阳性者为LTBI者的概率高。

（2)由于EC-ST 与IGRA
检测均利用卡介苗中丢失相关蛋白的原
理，理论上EC -S T 和IG RA 在结核病患者或卡介苗 接种者的阳性检出率差异应无统计学意义。

（3)由 于EC -S T 与T S T 所用抗原不同，理论上结核病患 者EC -S T 和T S T 应均为阳性，二者阳性率差异应 无统计学意义；而卡介苗接种者中，T S T 应为阳性，
EC -S T 应为阴性，二者阳性率差异应有统计学 意义。

临床研究结果表明：EC - S T 对确诊结核病患者 皮肤试验阳性检出率为90. 64%，对卡介苗接种者 阳性检出率为7.28%，与预期假设相符；在结核病 患者与卡介苗接种者中IG R A 阳性检出率分别为 91. 15%与4. 75%，与E O S T 检测结果比较，差异 无统计学意义；提示EC -S T 临床使用效果与IGRA 一致性较好。

考虑到EC -S T 价格低、操作简便，较
IG RA 更适合用于L T B I 者的筛查。

结核病患者中 丁3丁阳性率为90.90%，与£03丁比较差异无统计 学意义；但在卡介苗接种者中皮肤试验的阳性率高 达73. 42%，与EC -S T 比较差异有统计学意义，提 示EC -S T 可有效鉴别卡介苗接种与结核感染[8]。

二、不同人群结核感染程度与E C 阳性检出率 的关联性验证
E C 试剂应用的适应证之一为结核感染筛查。

本产品的ni 期临床试验研究中统计出结核病患者、 非结核呼吸道疾病患者、健康人群、卡介苗接种人群 等不同人群的EC -S T 阳性率；并根据免疫学检测阳 性检出率的高低，将受试人群分成高、中、低三种不 同等级[9];通过对不同人群的EC -S T 阳性检出率进 行汇总分析，探讨EC -S T 阳性检出率与受试者结核 感染程度的关联性，相关结果如下。

(一）结核免疫学检测高阳性率人群
此类人群包括病原学检测或临床诊断为结核病 患者，其EC -S T 应有高阳性检出率；在临床上与结 核病有类似症状，不能完全排除结核病的疑似患者， 其EC -S T 阳性率可能低于结核病患者，但高于健康 人群。

1.
菌阳肺结核患者：通过病理学检查或病原
体分离培养确诊的结核病患者，此类人群结核感 染可能性最大，其结核免疫学检测的阳性检出率 应最高。

2.
菌阴肺结核患者：缺少病理学和病原学诊断
依据的肺结核患者，易与其他疾病混淆，也可能为非 结核分枝杆菌感染；此类人群结核感染可能性较大， 其结核免疫学阳性检出率较高，但低于菌阳肺结核 患者。

3.非结核呼吸道疾病患者：指临床上有呼吸道 症状，诊断为非结核病，但极易与结核病患者相混 淆；此类人群可能包括结核病未检出，或非结核呼吸 道疾病患者，其结核免疫学阳性检出率应低于菌阴 肺结核患者。

(二） 结核免疫学检测中阳性率人群
此类人群包括已感染结核分枝杆菌但未发病、 已感染结核分枝杆菌但未检出、结核病患者的密切 接触者、结核病高发或低发地区的健康人群；此类人 群具有一定程度的结核感染风险，其结核免疫学阳 性检出率理论上应相对低于结核病患者或非结核呼 吸道疾病患者。

(三） 结核免疫学检测低阳性率人群
本项目中将结核感染低风险人群定位为：经结
核感染T 淋巴细胞斑点试验（T -SPOT . TB，IGRA 中的一种技术方法)、TST (m P P D 皮肤试验)、EC-ST 等3种免疫学检测结果均为阴性（简称“三阴性人 群”），且接种卡介苗或安慰剂的人群。

理论上，三阴 性人群接种安慰剂后，3种检测方法依然均为阴性； 三阴性人群接种卡介苗后，EC -S T 和T -SPOT . TB 检测结果应为阴性，T S T 作为卡介苗接种后阳转考 核方法，检测结果则为阳性。

上面3种情况是理论分析的预期皮肤试验结 果，在实际临床试验中，不同人群的3种免疫学检测 结果见图1。

EC -S T 与T -SP ( )T . T B 检测阳性率随 结核感染风险提高而增加，T S T 除卡介苗接种者阳 性率高于EC -S T 和T -SPOT . T B 外，其余结果变化 规律与EC -S T 和T -SPOT . T B 结果相似[8]。

上述 结果提示EC -S T 的阳性检出率的确与结核感染程 度密切相关，符合临床研究前对不同人群皮肤试验 反应结果的预期。

肺结核肺结核吸道疾病志愿者安慰剂接种人群
接种人群
图1 EC-ST 、TST 和T-SPOT. TB
在不同人群中的阳性检出率
E C与PPI)诱导的皮肤变态反应异同分析
P P D系由结核分枝杆菌培养滤液中提取的蛋 白，可诱导特异性迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，D TH);该蛋白含有致病性分枝杆 菌、环境中分枝杆菌及卡介菌的共有抗原，故TST 不能明确区分卡介苗免疫、外界分枝杆菌感染和结 核分枝杆菌感染，对卡介苗接种或者曾经感染但体 内未有存活结核分枝杆菌者依然呈阳性反应，TST 阳性只能代表其曾经感染分枝杆菌，无法真正判断 其是否发病或处于L T B I状态。

因此，寻找能区别 卡介苗接种还是结核分枝杆菌感染、结核分枝杆菌 感染者体内是否还存在活菌的诊断制品有着非常重 要的价值。

结核分枝杆菌差异区域1(region of difference-1，RD~1)的蛋白抗原，可诱发结核分枝杆 菌致敏的豚鼠发生D TH，其中最具代表性的是ESAT-6和CFP-10蛋白。

卡介菌在减毒及传代过 程中丢失了编码这些蛋白的基因，而且非结核分枝 杆菌中该基因只在少数分枝杆菌如堪萨斯、海、微黄 和苏加等分枝杆菌中存在。

作为皮肤试验变态反应 原，重组E C蛋白检测的特异性较强，且具有较强的 细胞免疫活性。

中国食品药品检定研究院以结核分 枝杆菌死菌、活菌和卡介苗分别致敏豚鼠，用PPD 和重组E C蛋白对致敏豚鼠进行皮肤试验，观察其 局部反应。

结果显示：重组E C蛋白仅与结核分枝 杆菌（活菌）致敏豚鼠呈阳性反应，对卡介苗致敏豚 鼠和灭活结核分枝杆菌致敏豚鼠呈阴性反应；而PPD对上述3种致敏豚鼠均呈阳性反应。

该结果 直观表明重组E C蛋白与卡介苗感染无交叉反应，有可能用于卡介苗接种与结核感染的鉴别[4’w]。

P P D与重组E C蛋白皮肤试验均可诱导D T H，其作用机理类似，即已致敏个体的淋巴细胞与结核 变态反应原（重组E C蛋白）发生特异性结合，引发 单核细胞浸润为主的免疫反应，释放趋化因子，使大 量多核细胞和淋巴细胞渗出；渗出的致敏淋巴细胞 合成并释放游走抑制因子、白细胞介素（I U-2、t干扰素（IFN-7)和肿瘤坏死因子（T N F)等细胞因子，免疫细胞由于游走抑制及其他细胞因子的作用而停 止移动并聚集，发育增殖，形成更多的免疫细胞聚 集，使皮肤反应呈现出迟发变态反应性炎症，注射局 部出现红肿、硬结。

尽管P P D与重组E C蛋白两种 变态反应原的作用机理类似，但二者抗原性与免疫 原性不同，诱导产生的局部皮肤变态反应也不尽相 同；P P D诱导的D T H其硬结的厚度相对较重组EC 蛋白诱导的更厚，而重组E C蛋白诱导的D T H其硬 结虽然小且薄，但其诱导产生炎性红晕反应明显大 于PPD，阳性反应的高峰时间也与P P D不完全一样[10]。

一、EC-S T诱导局部D T H反应的判断标准
虽然EC-S T诱导的D T H反应所产生的红晕或硬结均为特异性反应，但在临床研究中发现，肺结 核患者中以硬结为判断标准时，其阳性率低于以红 晕为判断标准的阳性率；在卡介苗或安慰剂接种者 中，以红晕与硬结两种判断标准的阴性率接近。

据 此可知，以红晕为判断标准可提高敏感度，且不产生 非特异性反应，故可以红晕为EC-S T的判断标准。

同时考虑到肤色较深的人群中可能红晕不易鉴别，且临床研究中发现部分受试者硬结反应大于红晕反 应，因此在EC-S T判断标准界定为“以红晕或硬结 大者为准，其反应平均直径（横径与纵径之和除以
2)不低于5 m m为阳性反应。

”
二、EC-S T和T S T的判读时间
传统T S T诱导的D T H是以皮肤试验后48〜 72 h的硬结平均直径作为判定标准，而EC-S T红晕 或硬结的平均直径均可作为阳性判定标准。

临床研 究结果提示，EC-S T皮肤试验后24〜72 h内均可进 行结果判读，用作结核病辅助诊断或L T B I筛查时，EC-S T的观察时间可提前至皮肤试验后24〜48 h;如果要进行疫苗接种人群筛查，需要与P P D同体双 臂进行皮肤试验，由于目前PPD观察时间为注射后 48〜72h，可取EC-S T与T S T后48 h作为共同观 察时间。

三、EC-S T与T S T对感染早期的应答
不同免疫学诊断方法对感染后免疫反应的应答 时间不同，EC-S T与T S T由于其抗原不同，引起的 免疫学阳性时间也有所不同。

无论是流行病学研究 还是临床辅助诊断，能越早检测出阳性反应的试剂 则性能越优。

研究者以活的结核分枝杆菌致敏豚鼠 模型，评价了 EC-S T与T S T对感染动物的早期免 疫应答[1W2]。

研究结果表明，动物采用活菌感染后 第10天E O S T有1/3动物阳转，第12天阳转率达 100%;而动物感染后第14天T S T仅有1/8动物阳 转，第28天则所有动物都阳转。

该结果提示EC-ST 早期应答能力优于传统T ST，但该结果还需做进一 步人体流行病学研究予以证实。

四、EC-S T与T S T引起的复强反应
结核菌素类皮肤试验制品蛋白相对的免疫原性 较低，P P D与重组E C 蛋白豚鼠致敏效应研究结果
都表明，即使以高浓度样品3次以上致敏动物后，以同品种变态反应原进行皮肤试验，也无法诱导动物 产生DTH。

但在临床实践中，皮肤试验阴性人群在 3个月后再次做皮肤试验，部分人群可能表现为阳 性。

这在结核病聚集性暴发疫情需进行二次皮肤试 验时，可能影响结果的可靠性。

中华人民共和国国 家卫生与计划生育委员会在《学校结核病防控工作 规范（2017版）》[13]中明确规定：“对密切接触者中 初次筛查T S T非强阳性者，应当在2〜3个月后再 进行T S T筛查，以便早期发现初次筛查时仍处于窗 口期的新近感染者”。

在重组E C蛋白的临床评价 研究中，健康受试者经EC-ST、T-SPOT.TB、TST 等3种方法筛选均为阴性反应者作为结核分枝杆菌 未感染者，对其接种卡介苗或安慰剂，12周后再进 行上述3种方法检测。

发现161例安慰剂接种者接 种后12周再次进行皮肤试验，EC-ST、T-SP(:)T.TB、T S T在该人群的诊断特异度（阴性符合率）分别为 88. 20%、93. 17%、60. 87%[8]。

传统 TST 的复强反 应严重程度明显高于重组E C蛋白，该结果提示在 结核病聚集性暴发疫情发生需进行流行病学筛查 时，EC-S T优于传统TST。

E C的使用
E C皮肤试验可单独用于结核病辅助诊断或L T B I的筛查；也可与PPD联合使用，用于结核疫苗 免疫接种人群的筛选与疫苗接种效果的评价，使用 方式见表1。

一、E C单独使用
(一）用于菌阴肺结核辅助诊断与LT B I高危人 群的筛查
在结核病诊断技术研究中，多数研究者更关注 菌阳结核病患者，更偏重于与病原体相关的核酸检 测技术的研发，忽略了绝大多数菌阴结核病患者核 酸检测依然阴性，核酸检测技术无法明显提高菌阴 结核病患者的检出率。

根据中国2000年和2010年全国结核病流行病学抽样调查结果，2010年全国活 动性、涂阳和菌阳肺结核患病率与2000年相比均呈下降趋势，其中涂阳肺结核患病率年递降率为9.0%，菌阳肺结核患病率年递降率为5.8%，但活 动性肺结核患病率下降率仅为0.2%，年递降率缓 慢；活动性肺结核患者中菌阴肺结核患者的比率则 由2000年的53.64%上升到74.07%。

由此可知，中国结核病患者主要为菌阴患者。

对菌阴患者而 言，E C为临床辅助诊断提供了新的选择。

此外，依据流行病学调查结果表明，活动性肺结 核患者中，未被发现的患者占89.5%，明显高于 2000年时新发现患者所占的比率（68.8% );在未 被发现的患者中无症状者2000年为12. 1%，2010 年则为43.1%，如果不对这些无症状结核病患者或 LTBI者实施主动筛查，并采取相应的治疗或预防 措施，终结结核病则难以实现。

考虑到全民筛查不 太现实，应采用合理的筛查方式对结核感染高危人 群实施筛查，可包括：（1)与结核病患者关联的高风 险者，如结核病患者密切接触者、医护人员、聚集性 结核病暴发相关人群。

（2)与其他疾病关联的高风 险者，如H IV感染者、糖尿病患者、风湿病，以及接 受免疫抑制剂治疗者、透析患者、矽肺患者等。

（3)特 殊人群、特殊环境中的高风险者，如羁押人员、社区 中老年人群、结核病高发区人群、流浪者、药物滥用 者、外来务工群居人员。

（4)国家规定须进行LTBI 筛查和预防性治疗的人群，如《学校结核病防控工作 规范(2017版）》规定，需加强学校L T B I者的筛查 和预防性治疗；中华人民共和国国家卫生健康委员 会印发的《中国结核病预防控制工作技术规范(2020 版）》提出，推行L T B I者中高危人群开展预防性治 疗，特别是H IV感染者及艾滋病患者、病原学阳性 肺结核患者5岁及以下儿童密切接触者，以及其他 LT B I高危人群。

(二）EC-S T与其他诊断方法的优缺点比较
目前，结核病其他免疫学诊断方法主要有IGRA、血清学检测与T ST;IG RA在结核病辅助诊 断与LT B I者筛查中具有较高的特异度，但实验步 骤多，操作相对复杂、难以标准化，不适合作为大规 模人群筛查的工具;且价格昂贵，难以在贫困地区推
表1E C单独或联合P PD进行皮肤试验的用途
制剂______________使用方式______________________________________________________________________________________________________ EC 单独使用结核病辅助诊断、结核感染流行病学调查、L T B I人群筛选（化学药物预防或免疫预防人群）PPD单独使用卡介苗接种效果考核、单一卡介苗或初免用疫苗接种人群筛选
潜伏性结核感染人群，以分别接种三类不同类型疫苗）
表2各类优点在3种潜伏性结核感染人群筛查方法中的比较
优点TST IGRA EC-ST 已广泛普及的方法+—+操作简便+-+无需抽血+—+阳性检出率相对高+—+价格便宜+—+不需要仪器设备+—+区分疫苗接种与结核感染-++鉴别结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌感染++特异度高-++适合大规模筛选+-+观察时间(h)48 〜722424 〜48注“+”代表“是”;“一”代表“否”
表3EC-ST与T S T联合使用结果判读与预防措施
EC-ST TST结果判读预防接种疫苗
—-未接种卡介苗或接种后阴转卡介苗或初免疫苗
—+卡介苗接种后，维持阳性加强免疫疫苗
++/_潜伏性结核感染免疫治疗用疫苗
注“ + ”代表阳性反应;代表阴性反应
广应用。

结核血清学检测技术由于可能产生假阳性 与假阴性，W H O在其政策建议中指出，使用目前市 面上商业性血液（血清学）检测手段诊断活动性结核 病，常常导致误诊和不当治疗，进而损害公众健康。

W H O敦促各国采用W H O推荐的准确的微生物或 分子检测方法，禁止使用不准确的和未经批准的血 液检测方法。

T S T是使用历史最悠久的结核病辅 助诊断方法，虽然方法简便，但所用试剂（PPD)无法 区分卡介苗接种与结核分枝杆菌感染，在中国15岁以上人口中T S T的阳性率高达44. 5%,以T S T作为结核病辅助诊断方法的假阳性率偏高、特异度 欠佳。

EC-S T采用传统T S T的简便技术，同时兼具 IGRA检测的特异度，主要优点见表2。

二、E C与PPD联合使用
通常传染性疾病的免疫预防主要针对未感染人 群，而结核病疫苗的接种对象存在未接种卡介苗或 卡介苗接种后阴转人群、卡介苗接种后依然维持阳 性人群，以及L T B I三类人群;这三类人群中免疫背 景与感染状态不同，采用的疫苗也将不同。

结核病 免疫预防对象的筛查可采用同体双臂方式以TST 和EC-S T检测结果为免疫标识，区分未接种卡介苗 或卡介苗接种后阴转人群、卡介苗接种后依然维持阳性人群及L T B I三类人群，分别接种不同类型疫 苗（表3)。

T S T与EC-S T检测均阴性者鉴别为未接种卡 介苗或接种后阴转人群，可接种卡介苗或初免用结 核疫苗;T S T阳性和EC-S T阴性者鉴定为接种卡 介苗后维持阳性人群，可接种加强免疫用疫苗;TST 阳性或阴性和EC-S T阳性者鉴定为LT B I人群，可通过免疫治疗方式预防感染人群发展为结核病。

结语
结核分枝杆菌重组变态反应原的研究已有20余年，但目前国内外在研的品种并不多，除了我 国的E C试剂外，国外主要有丹麦血清学研究所(SSI)研发的混合ESAT-6和CFP-10的C-t b试剂，以及俄罗斯研发的ESAT-6和CFP-10融合蛋白的 Diaskintest试剂。

在WH〇[14]《2〇19年全球结核病 报告》中首次介绍了上述2种试剂及重组结核分枝 杆菌变态反应原皮肤试验检测方法.W H O认为：这 种基于皮肤试验对新感染检测方法的出现，可最大 限度地实施检测平台的优势，并有提高对LTBI诊 治水平的潜力，与传统的T S T相比可提高和改善特 异度；该方法与IG RA相比，上述2种检测方法具有 相似的特异度，可为IG R A测试提供准确、可接受
和更便宜的替代方案。

由于不同产品的临床研究方案不同，目前除结 核病患者检测数据外，尚不能将国内的E C试剂与 O t b与Diaskintest试剂的研究数据进行直接比较。

根据C-t b的DI期临床研究[15]与Diaskintest研究者 在2019年最新发表的结核病患者检测数据[16]，EC 试剂检测的敏感度大于93%，优于C-t b的72%和Diaskintest的68 %;可能的原因是E C在重组蛋白 构建、人用剂量的选择方面较国外产品更为合理。

但E C尚缺少大规模的临床验证，如缺少E C皮肤试 验阳性反应与结核病发生发展关联性的研究数据；缺少E C皮肤试验对糖尿病、风湿病患者等特殊人 群的研究数据;缺少3岁以下65岁以上大样本人群 的安全性评价数据；缺少皮肤试验最佳观察时间及 不同肤色对皮肤试验反应结果判读的影响等数据。

这些都需要广大医护工作者在今后的临床研究中做 出共同努力，以便得到进一步完善。

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(收稿日期：2020-06-09)
(本文编辑:薛爱华）。