北京农学院生理实验指导

北京农学院
[自编教材指导书] 《植物生理学》实验指导李奕松姬谦龙厉秀茹葛秀秀王文平编
北京农学院生物技术学院
2011.2
目录
实验一质壁分离法测定细胞渗透势 (1)
实验二小液流法测定植物组织水势 (2)
实验三植物根系活力的测定（TTC法） (4)
实验四过氧化氢酶（CAT）活性的测定 (6)
实验五植物材料硝酸还原酶活性的测定 (8)
实验六叶绿体色素的提取、理化性质及定量测定. 10实验七植物细胞膜透性的测定 (13)
实验八植物光合速率的测定 (14)
实验一质壁分离法测定细胞渗透势
一、原理：
在生活细胞和外界溶液构成的渗透体系中，水分总是从高水势一方流向低水势一方。

将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间以后，有的细胞吸收水分，细胞膨胀；有的失去水分，细胞发生质壁分离。

如果在某一溶液中细胞脱水达到平衡时刚好细胞处在初始质壁分离状态，此时细胞内的压力势等于零，外界溶液的渗透势等于细胞渗透势，故此外界溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称之为该组织的等渗浓度。

根据公式即可计算出该组织细胞液的渗透势。

在实际测定时，由于临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，所以一般均以细胞初始质壁分离状态作为判断组织等渗浓度的标准。

如果细胞质壁分离较为明显，可根据引起质壁分离的溶液浓度，与相邻的不引起质壁分离的溶液浓度，取其平均值，求出组织等渗浓度，并计算出溶液的渗透势，即为该组织细胞的渗透势。

二、材料与设备：
1.植物材料：洋葱鳞茎、大葱、蚕豆叶片或其它植物叶片。

2.设备：显微镜1台、培养皿7套；滴管；载玻片、盖玻片各5片；镊子1把；单面刀1片；滤纸适量。

3.试剂：1.00 mol/L蔗糖溶液，0.03%中性红溶液.
三、实验步骤：
1. 以1.00 mol/L蔗糖溶液为母液,依照公式C1V1=C2V2配制0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mol/L蔗糖溶液各10ml于干燥清洁的小培养皿内备用。

注意盖上培养皿盖，防止蒸发浓缩。

2. 用刀片在洋葱鳞茎内表皮上划出边长为5mm的小方格，用镊子剥取内表皮数块浸入盛有0.03%中性红溶液的小培养皿内，染色3min，取出后放入盛有自来水的小培养皿内冲洗中性红在细胞间隙、细胞壁等上面的浮色，用滤纸吸干内表皮上的多余水分。

3.在盛有不同浓度蔗糖溶液的培养皿内分别放入染过色并漂洗后的内表皮数块。

20—30min后，按从高浓度到低浓度蔗糖溶液的顺序各取出内表皮小块，依次开始镜检，绘图记录质壁分离情况，求出组织细胞的等渗溶液浓度。

四、结果计算：
由所得到的组织细胞的等渗浓度和测定时的室温，用下式计算植物细胞的渗透势。

Ψs= -iCRT（MPa）
ΨS：为细胞渗透势，以MPa表示。

i ：为溶液的等渗系数（蔗糖溶液的i=1）。

C：等渗溶液的浓度（mol/L）。

T：为绝对温度，T=（273+t℃）K，t为实验时的室温。

R：为气体常数，R=0.008314（L·MPa/mol·k）
实验二小液流法测定植物组织水势
一、原理
水势表示水分的化学势，水分从水势高处流向低处。

植物体细胞之间、组织之间以及植物体和环境之间的水分移动方向都由水势决定。

当植物细胞或组织分别放在一系列浓度递增的溶液中时，如果植物组织的水势小于溶液的渗透势，则组织吸水而使外界溶液浓度变大；反之，则组织水分外流而使外界溶液浓度变小。

若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外界溶液浓度不变，而外界溶液的渗透势即等于所测植物组织的水势。

溶液浓度不同，比重不同，当两个不同浓度的溶液相遇时，稀溶液由于比重小而上浮，浓溶液则由于比重较大而下沉。

取浸过植物组织的溶液一小滴（为了便于观察可先染色），放在原来浓度的溶液中，观察液滴升降情况即可判断浓度的变化，如小液滴不动，则表示溶液浸过植物组织后浓度未变，即外界溶液的渗透势等于组织的水势。

二、材料与设备：
1. 植物材料：胡萝卜肉质根或其它作物的叶片。

2. 设备：青霉素瓶或小试管（12×10mm）6支（均具塞）；大试管（15×150 mm）6支（具塞）；10 ml移液管2支；1 ml移液管2支；毛细滴管6支；打孔器1个；温度计1支；解剖针1支；镊子1把。

三、实验步骤：
1、以1.00 mol/L蔗糖溶液为母液,依照公式C1V1=C2V2配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L）于6支干净、干燥的大试管中，各管加塞，并编号。

按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。

2、另取6支干净、干燥的青霉素瓶，编定序号，按顺序放在试管架上，作为试验组。

然后由对照组的各试管中分别取溶液1ml移入相同编号的实验组试管中，加塞，备用。

3、取胡萝卜肉质根或剪下具有代表性的新鲜叶片立即用打孔器打叶园片。

注意实验材料的取样部位一定要一致，若为叶片组织要避开大的叶脉部分。

迅速将适量植物材料放在每个小试管或青霉素瓶中。

一般胡萝卜肉质根放入8片（厚约1mm）左右，叶片材料放入20片左右。

摇动小瓶，使植物材料浸入到溶液中。

注意这个过程操作要快，防止水分蒸发。

放置20min。

在此期间摇动小瓶2—3次，使组织和溶液之间进行充分水分交换。

4、20min后，分别在各小瓶中加入甲烯兰粉末少许，摇匀，使溶液为蓝色。

按浓度依次分别用毛细吸管吸取蓝色溶液，轻轻插入相应浓度的试管中，伸至溶液中部，小心缓慢地放出蓝色溶液一小滴，慢慢取出毛细管（注意避免搅混溶液）。

观察并记录液滴的升降情况：如果有色液滴向上移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变小，植物组织失水，表明植物组织的水势高于该浓度溶液的渗透势；如果有色液滴向下移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变大，植物组织吸水，表明植物组织的水势低于该浓度溶液的渗透势；如果液滴静止不动，则说明植物组织的水势等于该浓度溶液的渗透势。

在测定中，如果在前一浓度溶液中液滴下降，而在后一浓度溶液中液滴上升，则该组织的水势为二种浓度溶液渗透势的平均值。

四、结果计算
记录液滴静止不动的试管中蔗糖溶液的浓度。

由所得到的等渗浓度和测定的室温，按下式计算植物组织的水势。

= - iCRT（MPa）
Ψ
W
ΨW：为植物组织水势，以MPa表示。

i ：为溶液的等渗系数（蔗糖溶液的i=1）。

C：等渗溶液的浓度（mol/L）。

T：为绝对温度，T=（273+t℃）K，t为实验时的室温。

R：为气体常数，R=0.008314（L·MPa/mol·k）
实验三植物根系活力的测定（TTC法）
一、原理
根是植物的重要器官，它不断生长，具有吸收水分和矿质养分的功能，而且还能进行合成代谢，如氨基酸、植物激素等的合成。

所谓根系活力是泛指根的吸收、合成代谢等等的能力。

根系活力与吸收作用的强弱有直接关系，与脱氢酶系活性的强弱成正比。

TTC法测定根系活力就是根据根系脱氢酶系氧化还原能力强弱而设计的。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为－80mv的氧化还原物质。

其氧化态无色，并溶于水，但被还原后即生成不溶于水的三苯基甲腙，呈红色，它在空气中不会自动氧化，相当稳定，所以可用TTC作为脱氢酶的氢受体.
植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡素酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸等所严重抑制。

所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

二、材料与设备
1. 植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或仔细洗净泥土的植物幼苗的根。

玉米根系发达，是较好的实验材料。

2. 设备：721型分光光度计；温箱；电子天平；研钵1套；镊子1把；漏斗1个；刻度吸管2ml 1支、10ml 2支、0.5 ml 1支；容量瓶10ml 1个、刻度试管20 ml 6支；烧杯500 ml 1个；石英砂适量。

3. 试剂
[1]、乙酸乙酯（分析纯）500 ml；
[2]、分析纯连二亚硫酸钠（Na2S204）粉末少许；
[3]、1%TTC溶液，准确称取TTC 1.000g，溶于水中，定容至100 ml；溶液pH应在6.5~7.5，以pH试纸试之，如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水。

[4]、0.4%TTC溶液，准确称取TTC 0.400g，溶于水中，定容至100 ml；
[5]、1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.0），配制方法为：A液：称取分析纯Na2HP04·2H20 11.876g溶于蒸馏水中成1000 ml，B液：称取分析纯KH2P04，9.078g溶于蒸馏水中成1000 ml。

用时取A液60ml、B液40 ml混合即成。

[6]、1mol/L硫酸：用量筒取出比重1.84的浓硫酸55 ml，边搅边加入盛有500 ml dH2O 的烧杯中，冷却后稀释至1000 ml。

三、实验步骤（定量测定）
（1）TTC标准曲线的制作：吸取0.25 ml 0.4% TTC溶液放入10ml刻度试管中，加入少许Na2S204粉末[应尽量多加一些，以使TTC充分还原]，摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙。

用乙酸乙酯原液定容至刻度，摇匀。

然后分别取此液0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 ml置10 ml刻度试管中，分别加乙酸乙酯4.90，4.75，4.50，4.25，4.00ml，即得到含三苯基甲腙0.01，0.025，0.05，0.075，0.10 mg的标准比色系列，以乙酸乙酯做空白作参比，在485nm波长下测定光密度。

以TTC还原量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）剪取植物根尖1cm部分为实验材料，称取0.1g，放入刻度试管中，加入0.4%TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 ml，把根充分浸在溶液内，在37℃下保温40-60min，植物根尖部分成为红色。

之后加入1mol/L硫酸2 ml，以停止反应。

空白试验为先加硫酸再加入根样品，其它操作相同。

（3）用镊子将根夹出，冲洗后擦干表面水分，加入少许乙酸乙酯和少量石英砂在研钵内研磨，以提取出红色的三苯基甲腙，把红色浸提液滤入试管，并用乙酸乙酯洗涤研钵中的
残渣2—3次，至到残渣为白色。

然后用乙酸乙酯将浸提液定容至5 ml。

浸提液在485nm下比色，以空白试验（先加硫酸到再加入根样品操作得到的溶液）作参比，读出光密度，查标准曲线，求出TTC还原量。

四、结果计算：
TTC还原量（mg）
TTC还原强度= ——————————————————（mg·g-1·min-1）
根重（g）×酶促反应时间（min）
实验四过氧化氢酶（CAT）活性的测定
一、原理：
过氧化氢酶（CA T）在植物体内普遍存在，它能把过氧化氢分解为水和氧气。

其活性大小以一定时间内分解的过氧化氢量来表示。

让酶与定量的底物（过氧化氢）进行定时的反应，反应结束后，再用碘量法测定剩余的过氧化氢量。

以钼酸铵作催化剂，过氧化氢与碘化钾在酸性条件下反应，放出游离碘。

然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应为：
H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2O
I2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6
根据空白（不加酶液）和测定（加酶液）二者滴定值之差，即可求出酶分解的过氧化氢量。

酶活性单位为：分解H2O2 mg/g·min
二、材料与设备
1. 植物材料：小麦或其它植物叶片
2. 设备：电子天平；研钵一套；100ml三角瓶4个；100ml容量瓶2个；50ml酸式滴定管1支；恒温水浴；漏斗1个；滤纸适量；移液管10ml 1支、5ml 2支、1ml 1支。

3. 试剂：
[1] 碳酸钙粉末。

[2] 1.8mol/L硫酸：取1000ml烧杯1只，加入约500mldH2O，边搅拌边加入100 ml浓硫酸，冷却后，用容量瓶定容至1000ml。

[3] 10%钼酸铵溶液。

[4] 1%淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80ml沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾，冷却后贮于滴瓶中。

[5] 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液：称取Na2S2O3·5H2O 25g溶于新煮沸并冷却过的dH2O中，加入约0.1gNa2CO3，并稀释至1L。

保存于棕色试剂瓶中，放置暗处，一天后进行标定。

标定方法：精确称取分析纯K2Cr2O7约0.15g置于500ml三角瓶中，加30mldH2O溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液从棕红色变成浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由兰色变成亮绿色（Cr+++离子的颜色）为止，计算出Na2S2O3的摩尔浓度。

[6] 0.02mol/L硫代硫酸钠：吸取20ml标定过的0.1mol/L硫代硫酸钠溶液，加入到100ml 容量瓶中，加dH2O定容到刻度。

注意现用现配。

[7] 0.06mol/L过氢化氢，取1ml30%的过氧化氢用dH2O称释至150ml。

三、实验步骤：
1、酶液提取：称取剪碎混匀的新鲜小麦叶片1g置于研钵中，加0.2g碳酸钙和dH2O 2ml，仔细研磨成匀浆。

过滤至100ml容量瓶中，用dH2O称释至刻度，振荡片刻，静置。

取10ml 溶液再移入另一容量瓶中，加dH2O至刻度，摇匀备用。

2、测定：取100ml三角瓶4个，编号。

每瓶加酶液5ml，立即向
3、4号瓶中加入1.8mol/L 硫酸3ml，终止酶的活性，作为空白测定。

然后将各瓶放在20℃水浴中保温，10min后依次向各瓶加入3ml 0.06mol/L过氢化氢，摇匀并记录加入时间，让酶作用5min，再依次向1、2号瓶各加入3ml 1.8mol/L硫酸。

然后4个瓶各加入1ml 20%碘化钾、3d钼酸铵及5d淀粉指示剂，用0.02mol/L硫代硫酸钠滴定到兰色消失。

四、过氧化氢酶活性的计算：
从空白测定的硫代硫酸钠滴定值减去样品测定的滴定值，即可求出此期间过氧化氢酶所分解的过氧化氢量。

[空白滴定值（ml）－样品滴定值（ml）]
被分解的H2O2量（mg）= ———————————————————×硫代硫酸钠（mol/L）×34
2
注：34为H2O2的分子量
被分解H2O2量（mg）
———————————×酶液总体积（ml）
测定时用酶液（ml）
CAT活性（H2O2 mg/g·min）= ——————————————————————
样品重（g）×时间（min）
实验五植物材料硝酸还原酶活性的测定
一、原理：
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。

其反应式为：NO3-+ NADH + H+—→ NO2- + NAD ++ H2O 。

硝酸还原酶活性高低以生成的亚硝态氮衡量，酶活性一般以单位时间每克鲜重植物材料还原生成的亚硝态氮含量表示，即以NO2-ug/g.h为单位。

NO2-含量的测定可用磺胺比色法，该方法能测定的NaNO2 浓度为0.5ug/ml。

亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

硝酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，硝酸还原酶不用从植物组织中提取出来，其作用产物NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，通过测定反应液中NO2-含量的增加，即能表明酶活性的大小。

硝酸还原酶是一种诱导酶，当向培养介质中加入硝酸盐时，植物体内很快就会出现硝酸还原酶。

二、材料设备：
1. 植物材料：小麦、玉米或其它植物材料的叶片。

2. 设备：分光光度计；真空抽气装置；温箱；打孔器；电子天平；小三角瓶；试管；移液管5ml的2支、2ml的4支。

3. 试剂：
[1]、0.2 mol/L硝酸钾溶液：溶解10.11g硝酸钾于dH2O中，定容至500ml。

[2]、0.1 mol/L磷酸缓冲液，PH=7.5
A液：0.2 mol/L NaH2PO4，取NaH2PO4 27.8g, dH2O溶解，配制成1000ml溶液。

B 液：0.2 mol/L Na2HPO4，取Na2HPO4 71.7g，dH2O溶解，配制成1000ml溶液。

取A液16ml、B液84 ml，混合，用dH2O稀释至200ml。

[3]、磺胺试剂：1g磺胺（或对氨基苯磺酸）加25ml浓盐酸，用dH2O稀释至100 ml。

[4]、α-萘胺试剂：0.2g α-萘胺溶于含1 ml浓盐酸的dH2O中，定溶至100ml。

或将α-萘胺溶于25ml的冰醋酸中，用dH2O稀释至100ml。

[5]、亚硝酸钠标准液：称取AR级NaNO20.1000g，用dH2O溶解、定溶至100ml，取5ml，再用dH2O稀释至1000ml，即为NO2-含量是5ug/ml的标准液。

三、实验步骤
1、将新鲜的叶片用水洗净，吸水纸吸干表面水分，然后用打孔器打成直径为1cm的园片，称取等量叶园片2份（每份0.2—0.3g），用dH2O 洗涤2—3次，吸干水分，分别置于
（1）0.1mol/L磷酸缓冲液(PH7.5) 5ml + dH2O 5ml,(2)0.1 含有下列溶液的2个50ml三角瓶中：
mol/L磷酸缓冲液(PH7.5) 5ml + 0.2mol/L KNO3 5ml。

注意将溶液浸没植物材料，然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气7-10min，放气后，园片即沉于溶液中。

将三角瓶置于30℃温箱中，不见光，保温30min。

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使酶的活性降低。

2、NO2-含量测定：
保温30min结束后，分别取出1ml反应液于试管中，加入磺胺试剂或对氨基苯磺酸2ml，
摇匀。

再加入α-萘胺试剂2ml，摇匀。

注意各试剂的加入顺序。

在30℃温箱中保温30min，用分光光度计在520nm波长比色，测定光密度。

从标准曲线上查得NO2-含量，然后计算酶活性。

单位为NO2-ug/g.h。

3、标准曲线的制作：取7支试管，编号，按下表顺序添加试剂，每加入一种试剂后注意摇匀。

待试剂加完后，将各试管置30℃温箱中保温30min，立即于520nm波长下进行比色，读出光密度，以光密度为纵坐标，NO2-浓度为横坐标绘制标准曲线。

◆注意：测定NO2-的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1ug/ml的NaNO2含量，由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准曲线与样品的测定都在相同条件下进行则显色速度相等，彼此可以比较。

制作标准曲线的试剂配比———————————————————————————————————————试管号 NaNO2标准液（ml）dH2O（ml）磺胺试剂（ml）α-萘胺（ml）NO2-μg/管———————————————————————————————————————
1 0 1
2 2 0
2 0.1 0.9 2 2 0.5
3 0.2 0.8 2 2 1
4 0.4 0.6 2 2 2
5 0.
6 0.4 2 2 3
6 0.8 0.2 2 2 4
7 1.0 0 2 2 5 ———————————————————————————————————————
四、结果计算:
硝酸还原酶活性
g·g-1·h-1）
实验六叶绿体色素的提取、理化性质及定量测定
I. 叶绿体色素的提取、理化性质
一、原理：
叶绿体中含有绿色素（叶绿素a和b）和黄色素（胡萝卜素和叶黄素）。

这两类色素能溶于有机溶剂，且各种色素的脂溶性不同。

根据它们在有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙酮等）中的溶解特性，可将它们从叶子中提取出来。

叶绿素是一个双羧酸的脂，在碱的作用下，可发生皂化反应。

在酸性条件下，叶绿素啉环中央的镁可被氢取代，于是叶绿素成为褐色的去镁叶绿素。

叶绿素中的镁也可被铜、锌等金属离子取代，此时叶绿素仍可保持绿色。

叶绿素在光照下会发出暗红色的荧光。

二、材料与设备：
1. 植物材料：新鲜植物叶片。

2. 设备：研钵一套；漏斗一个；剪子一把；细玻璃棒一支；烧杯（50ml）1支；20ml 刻度试管5支；5 ml刻度试管2支；25 ml刻度吸管2支；酒精灯；石棉网；铁三脚架；滤纸适量。

3. 试剂：丙酮；CaCO3; 80%丙酮；苯；醋酸酮粉末；50%醋酸；KOH-甲醇溶液（20克KOH溶于100ml甲醇中）
三、实验步骤：
1. 色素的提取
取洗净新鲜的植物叶子5克，剪碎放入到研钵中，加入少量碳酸钙和石英砂，再加入10ml丙酮，研磨至丙酮染成深绿色，将丙酮提取液滤入小烧杯内，再用10ml丙酮重复研磨，过滤，滤液待用。

2. 理化性质的测定
1）皂化作用
用移液管吸取叶绿素提取液5ml，放入一大试管中，再加入1.5ml 20% KOH-甲醇溶液，摇匀。

片刻后加入5ml苯，摇匀。

沿试管璧加入蒸馏水1 ml，轻轻转动试管，静置于试管架上，可看到溶液逐渐分成两层，上层是苯溶液，其中溶有黄色的类胡萝卜素，下层为稀的丙酮溶液，其中溶有绿色的皂化的叶绿素a和b。

2）取代作用[H+ 和Cu2+ 对叶绿素分子中Mg2+的取代]
用移液管吸取叶绿素提取液5ml，放入试管中，加入50%醋酸数滴（或浓HCL 1~2滴），摇匀，可观察到溶液由绿色变成褐色，此时叶绿素分子中的Mg2+被H+取代，为去镁叶绿素。

之后将溶液倒一半于另一试管中，加醋酸酮粉末少许，微微加热，则溶液颜色又变成绿色，此时去镁叶绿素分子中的H+被Cu2+取代，为铜代叶绿素。

将两试管中的溶液进行比较。

3）荧光现象的观察
取叶绿素提取液，放入试管中，在反射光下观察，溶液的颜色为暗红色，为叶绿素荧光现象；在透射光下为绿色，是由于叶绿素分子不吸收绿色光的原因。

II.叶绿素的吸收光谱与定量测定
一、原理
实验目的：掌握TU-1800紫外分光光度计的使用，学习测定叶绿素的含量及吸收光谱的测定方法。

根据叶绿素对可见光有特定的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，利用公式计算叶绿素的含量。

该法不但精确度高而且能在未分离的情况下，分别测定叶绿素a和叶绿素b的含量。

已知叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和645nm ,又已知在波长663nm 下叶绿素a、b的80%丙酮溶液的比吸收系数为82.04和9.72，在波长645nm下分别为16.75和45.60。

其关系式：
D663 = 82.04Ca + 9.72Cb (1)
D645 = 16.75 Ca + 45.6Cb (2)
D663 、D645：分别为叶绿素溶液在波长663nm和645nm的光密度。

Ca 、Cb：分别为叶绿素a、b的浓度，单位为mg/L
解方程(1) (2)得：
Ca = 12.7 D663 －2.59 D645 (3)
Cb = 22.9 D645 －4.67 D663 (4)
Ca与Cb 相加，既得叶绿素总量C T
C T= Ca + Cb = 20.3 D645 + 8.03 D663 (5)
根据叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸光系数（34.5），即可在此波长下测定光密度（D652）而求出叶绿素总浓度C T：
D652 × 1000
C T（mg/L）= ———————— (6)
34.5
二. 材料和设备：
1. 实验材料：菠菜叶片
2. 设备：756紫外分光光度计，电子天平，研钵一套，漏斗一个，25ml容量瓶一个
3. 试剂：80%丙酮，CaCO3粉末
三. 实验步骤：
1. 叶绿素提取液的置备：称取新鲜干净的叶片（去主脉）0.1克，剪碎，放入研钵中，加入少量CaCO3粉末和石英砂，加入80%丙酮，仔细研磨成匀浆，再加入适量丙酮，继续研磨至组织残渣变为白色，静止片刻，将提取液过滤至25 ml容量瓶中，再用80%丙酮冲洗研钵和滤纸，将色素冲洗干净，最后用80%丙酮定容至25 ml，摇匀、待用。

2.光密度测定与吸收光谱扫描：以80%丙酮做对照，按下列步骤输入程序：
1) 开机：依次打开外部电源(如稳压器)、主机电源。

2) 仪器自检：当打开仪器电源时，仪器便进入自检程序，自检各项都“OK”后，进入选择工作方式界面；预热半小时后进行以下操作。

3）光度测量未知叶绿素a、b总浓度的测定：
3.1进入光度测量(652nm,)：在选择工作方式界面中按①键进入光度测量。

3.2 参数设置：按选测光方式为“Abs”，按
按F2键进入测量模式；按
3.3
校完后取出参比溶液。

将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池内，按
即可测量样品Abs值。

4.1 进入光谱测量：在选择工作方式界面中按②键进入光谱测量。

4.2 参数设置：按F1进入参数设置：（1）测量波长范围(700-300)；（2）记录范围（0-3）；（3）；（4）光度方式(一般为Abs)；（5）扫描速度（一般为中速）。

参数设
键退出参数设置。

在第一样品池中放入参比溶液，
校完后取出参比溶液。

：将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池中，按
仪器自动进行扫描。

四、叶绿素含量的计算：
按公式（3）、（4）分别计算叶绿素a、b的浓度，相加既得总浓度，也可按公式（6）直接算出叶绿素总浓度。

然后按公式（7）或（8）算出叶绿素总含量：
C T(mg/L) ×提取液总体积(L) ×稀释倍数
叶绿素含量（鲜重%）= —————————————————×100% (7)
样品鲜重（mg）
C T(mg/L) ×提取液总体积(L) ×稀释倍数
叶绿素含量（mg/g）= ————————————————————— (8)
样品鲜重（g）
实验七植物细胞膜透性的测定
一、原理：
植物组织受不良环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，使细胞膜透性增大，导致细胞的内含物会有不同程度的外渗。

若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量增加。

组织受伤害越严重，电解质含量增加得越高。

用电导仪测定外渗液电导度的变化，可反映出质膜受伤害的程度。

透性变化愈大，电导度愈大，表示受伤害愈重，也就表示抗性愈弱。

二、材料与设备：
1. 植物材料：选取小麦或其它作物一定叶位和叶龄的功能叶片。

2. 设备：电导仪1套，真空抽气装置1套；50ml三角瓶3只；剪子1把；滤纸适量，打孔器1个，玻棒2根。

3. 试剂：ddH2O或去离子水。

三、实验步骤：
1、清洗用具：电导法对水和容器的洁净度要求严格，器皿稍有杂质即产生电导度的很大误差。

故所用玻璃用具洗净后，再用自来水、无离子水冲洗四、五次。

倒置于洗净而垫有洁净滤纸的盘中。

2、取样及处理：分别在正常生长和逆境胁迫的植株上取同一部位的功能叶若干片，分成2份。

用纱布擦净表面灰尘。

将其中一份低温处理：放在-20℃左右的温度下冷冻20min （或高温处理：置40℃左右的恒温箱中处理30min）；另一份裹入潮湿的纱布中放置在室温下作对照。

处理后分别用去离子水冲洗两次，用洁净的滤纸吸干，然后用打孔器（1cm2）将叶片打取12个叶园片，分别放入三角瓶中，准确加入20 ml的无离子水，浸没叶片，然后放入真空抽气装置中抽气约10min，以抽出细胞间隙空气，缓缓放气，水即渗入细胞间隙，叶子变成透明状，沉在三角瓶底部，取出三角瓶，放在室温下保持30min，间或摇动几次。

3、测定：将电导仪的电极插入三角瓶中，测定外渗液的电导值，记录其初始电导值（S1）。

之后，将三角瓶放入沸水浴中5—10min，以杀死组织。

待冷至室温后，再次测定外渗液的电导值（S2）。

四、结果计算：
按下式计算相对电导度：
相对电导度（L）=S1/S2
相对电导度的大小表示细胞受伤害程度。

由于对照（在室温下）也有少量电解质外渗，故可按下面公式计算由于高温或低温胁迫而产生的外渗，称为伤害度。

伤害度（%）= （L t– L ck）/ （1-L ck）×100%
式中：L t——处理叶片的相对电导度；
L ck——对照叶片的相对电导度。