虎鼬肾组织结构及水通道蛋白1_2的表达.

将虎鼬肾组织沿扇面斜横向截切，再切成常规 大小的组织块，投入 10% 福尔马林溶液固定 2 d ， 常规石蜡包埋，用切片机 （ YD － 202 上海珂淮仪 器有限公司） 将组织块纵向切片，制成 6 μm 的切 片，H. E 染色后在显微镜 （ Olympus，FX235WA ， Japan） 下观察、测量、拍照。每个样本取 6 张切 片，在每张切片中分别取肾近曲小管、远曲小管、 细段、近直小管、远直小管、集合管各自分布比较 多的视野 10 个，共 60 个视野，用测微尺分别测量 各段泌尿小管的管径及管腔直径，测量 5 个样本， 最后求平均值。每个样本取 6 张切片，在每张切片 皮质选择 10 个视野，用测微尺测量肾小体、血管 球直径，统计近曲小管和远曲小管截面数量，在解 剖镜下用测微尺测量肾皮质髓质比，测量 5 个样 本，求平均值。
虎鼬心脏取血，收集的血液置于室温下 1 h 左 右，待凝固后冷冻离心机 （ TD5KＲ，长沙东旺实 验仪器有限公司） 离心 （ 3 000 r / min，10 min） 收 集血清，用干湿电解质分析仪 （ DSI903，岳 阳 市 合锦医技医疗设备有限公司） 通过离子电极法测 定钾 （ K + ） 、钠 （ Na + ） 、氯 （ Cl － ） 浓 度； 其 它 生化指标均由全自动生物化学分析仪 （ 日立 7180） 测定，使用钙测定试剂盒 （ 甲基麝香草酚兰比色 法） 、血清镁测定试剂盒 （ 二甲苯胺兰比色法） 、 无机磷检测试剂盒 （ 钼兰比色法） 、尿素氮检测试 剂盒 （ 酶法） 、肌酐检测试剂盒 （ 酶法） 和葡萄糖 测定试剂盒 （ 葡萄糖氧化酶法） 、二氧化碳检测试 剂盒 （ 酶法） 和血脂测定试剂盒 （ 直接测定法） ， 具体步骤参照各试剂 （ 盒） 说明书。所测各项数 据分别取其平均值。 1. 3 光镜观察
基金项目： 甘肃省科技计划资助项目 （ 1304FKCG103） ； 甘肃省教育厅研究生导师科研项目 （ 0801 － 06） 作者简介： 张春燕 （ 1980 － ） ，女，硕士，讲师，主要从事细胞与发育生物学研究 . 收稿日期： 2013 － 10 － 29； 修回日期： 2014 － 06 － 13 * 通讯作者，Corresponding author，E － mail： houtd@ nwnu. edu. cn
Abstract： Indices such as many kinds of blood inorganic ions and urea nitrogen were measured in this paper． The histological structure of kidney in Vormela peregusna was examined by using biological microscopy． The expression of Aquaporin1，2 （ AQP1，2） was tested using immunohistochemical and stereological quantitative methods，and the expression intensity of Aquaporin1，2 （ AQP1，2） was analyzed by using image pro-plus （ IPP） image software． The results show that the concentration of K + ，Na + ，Cl － ，Ca2 + in serum of Vormela peregusna is higher than that in rat，however P3+ is lower than that in rat. Creatinine，glucose and total cholesterol in serum also are higher than those in rat． Urea nitrogen is much higher than that in rat，and may be related to living in the Minqing Gansu desert and eating rodents that have high protein content． The degree of concentration of urine is high because the ratio of medulla and cortex is 3. 65 ∶ 1 and medulla is wide． AQP1 positive cells were expressed in the epithelium of proximal the convoluted tubule and thin segments of the medullary loop，and AQP2 was mainly expressed in epithelial cells of collecting ducts. Thus，AQP1，2 may play an important role water reabsorption by the kidney and the concentration of urine，which regulated by the water balance of kidney． Key words： Immunohistochemistry； The histological structure of kidney； The expression of aquaporin 1，2 protein； Vormela peregusna
1. 4 免疫组织化学 （ SABC 法） 虎鼬称重，解剖未发现有病理变化，迅速取两
侧肾组织，放入预冷的生理盐水，洗去血迹，将肾 组织切成常规大小的组织块，投入 10% 福尔马林 液固定 24 h 后，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包 埋后，制成厚 6 μm 的连续切片，切片常规脱蜡至 水。3% H2 O2 室温 5 － 10 min 以灭活内源性过氧化 物酶活性，蒸馏水洗 3 次。将切片浸入 0. 01 mol / L 枸缘酸盐缓冲液 （ pH6. 0 ） ，微波炉 （ Galanz，格 兰仕集团） 加热修复抗原，加热至沸腾后断电， 间隔 5 － 10 min 后，反 复 1 － 2 次。冷 却 后 PBS （ pH7. 2 － 7. 6） 洗涤 1 － 2 次。滴加 5% BSA 封闭 液，室温 20 min，封闭非特异性反应位点。甩去多 余液体，不洗。滴加适当稀释的一抗 （ 兔抗鼠水 通道蛋白 1 或兔抗鼠水通道蛋白 2，工作浓度为 1∶ 1200） ，置 4℃ 冰 箱 孵 育 过 夜，PBS （ pH7. 2 － 7. 6） 洗涤 2 min，3 次，滴加生物素化山羊 抗 兔 IgG，室温孵育 30 min，PBS （ pH7. 2 － 7. 6） 洗涤 2 min，3 次。滴加试剂 SABC （ 链霉素 － 抗生物素 蛋白 － 过 氧 化 物 酶 复 合 物 工 作 液） ，室 温 孵 育 30 min，PBS （ pH7. 2 － 7. 6 ） 洗 涤 5 min，4 次， 空白对照用 PBS 代替一抗。使用 DAB 显色试剂盒 显色，蒸馏 水 洗 涤， 苏 木 精 轻 度 复 染， 脱 水、 透 明、封片， 光 镜 观 察 并 拍 照。 兔 抗 鼠 水 通 道 蛋 白 1、兔抗鼠水通道蛋白 2、即用型链霉亲和素 － 生 物素 － 过氧化物酶复合物 （ SABC） 免疫组化试剂 盒、DAB 显色剂均购于武汉博士德生物工程有限 公司。 1. 5 体视学测量
兽类学报，2014，34 （ 4） ： 406 － 413 Acta Theriologica Sinica
虎鼬肾组织结构及水通道蛋白 1，2 的表达
张春燕1 侯天德2* 徐登翠1 丁卫刚1 张慧瑛1
（ 1 河西学院农业与生物技术学院，张掖 734000） （ 2 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）
的排泄有关 （ 叶润蓉和曹伊凡，1999） 。水通道蛋 白 （ Aquaporins，AQPs） 是 肾 重 吸 收 水、 浓 缩 尿 液、维持机体水平衡的重要分子基础 （ 张艳敏和 郭勇，2003） 。AQP1 主要分布于近曲小管及髓袢 降支薄壁段上皮细胞顶质膜，其表达与这两个肾小 管节段内极高的水渗透系数呈显著正相关 （ Nielson et al. ，1993 ） ， 介 导 原 尿 中 的 水 分 重 吸 收。 AQP2 位于肾脏集合管主细胞的胞浆和顶质膜上， AQP2 在 肾 尿 浓 缩 机 制 中 起 重 要 作 用 （ Nielsen et al. ，2002） 。虎鼬捕获自甘肃民勤县，该地区位于 腾格里沙漠和巴丹吉林沙漠之间，温暖少雨，属半 年以上旱季的荒漠带，本文检测了虎鼬血清中无机 离子、尿素氮等生化指标，对虎鼬肾的组织结构进
4期
张春燕等： 虎鼬肾组织行了光镜观察，并运用免疫组织化学方法检测了 AQP1，2 在虎鼬肾的表达，以探讨虎鼬肾维持机 体水平衡适应其荒漠生存环境的初步机理。
1 研究方法
1. 1 实验材料 虎鼬 5 只，雌雄不限，体重 356 － 380 g，2011
年 5 月捕获自甘肃省民勤县荒漠，捕获后在实验室 安静环境、室温 20℃ － 25℃ 下饲养半天，饲喂小 鼠和谷物，使用 1% 戊巴比妥钠腹腔麻醉。 1. 2 血清无机离子、尿素氮、尿酸等指标测定
关键词： 虎鼬； 血清指标； 肾组织结构； 水通道蛋白 1，2 的表达； 免疫组织化学
中图分类号： Q958
文献标识码： A
文章编号： 1000 － 1050 （2014） 04 － 0406 － 08
Light microscope structure of Vormela peregusna kidney and expression
of AQP1，2 in kidney
ZHANG Chunyan1 ，HOU Tiande2 * ，XU Dengcui1 ，DING Weigang1 ，ZHANG Huiying1