水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析

水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析
查中萍;李进波;万丙良;戚华雄
【摘要】启动子是基因表达的重要调控元件.利用PCR方法克隆了控制水稻颖壳发育的候选基因TWH1的启动子,并将启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达栽体.通过农杆菌介导的方法将其导入水稻愈伤组织,转基因植株经GUS染色分析显示,各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳中都有GUS 活性表达,但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性.该结果对进一步研究TWH1基因的功能奠定了基础.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2010(049)010
【总页数】3页(P2341-2343)
【关键词】水稻;颖壳;TWH1 基因
【作者】查中萍;李进波;万丙良;戚华雄
【作者单位】湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉,430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉,430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉,430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉,430064
【正文语种】中文
【中图分类】S511%Q785
花器官的发育是植物从营养生长转变为生殖生长的关键标志之一，其产物是植物繁
殖后代和种群扩散的重要手段。

水稻是我国重要的粮食作物。

水稻生产中，其产量和品质都将受到水稻花器官发育的影响，因此对水稻花器官发育的研究一直是水稻遗传育种工作者关注的重点。

内、外稃是水稻花器官的重要组成部分，它直接影响稻谷的外形和体积，与稻米的产量、品质密切相关。

研究水稻内、外稃的发育调控不仅具有重要的理论意义，而且还对水稻产量和品质的遗传育种具有重要的指导意义。

特殊的花器官突变体是研究水稻颖花发育分子机理的重要试验材料。

目前，水稻中已发现多个与花器官发育有关的突变体，如突变体fro1和ps－2［1］，浆片叶化突变体 lfl（Leafy lodicules）［2］、叶状颖壳突变体 Oslh［3］、长颖壳突变体lh［4］、Oseg1［5］、多重颖壳突变体［6］、水稻花器官数目突变体 fon（t）［7］等。

这些突变体的发现及其相关研究使得人们对水稻花器官发育机制有了进一步的理解。

本课题组从水稻育种后代材料中发现一个颖壳扭曲突变体twh1，该突变体主要表现为颖壳扭曲变形，但雌、雄蕊等其他花器官皆发育正常，与已经报道的颖壳异常突变体完全不同，是一个新的水稻颖壳异常突变体［8］。

研究结果表明，该突变体颖壳扭曲性状受1对隐性基因控制，其对应的TWH1基因被精细定位在第二染色体的SSR标记RML25和RML35之间，两个SSR标记间的物理
距离为11.9 kb，并确定了其候选基因。

植物基因的表达受启动子的控制，启动子的活性间接反映了它所控制的基因的表达，所以人们通常利用启动子与GUS报告基因的融合系研究基因的表达情况。

本研究利用PCR技术从水稻基因组DNA中分离出TWH1基因的启动子序列，构建了与GUS报告基因相融合的植物表达载体，以期了解TWH1基因时空表达特性及该基因在水稻颖花发育中的功能，同时为通过基因工程方法调控TWH1基因表达，从
而为改善水稻颖花发育提供信息。

1 材料与方法
1.1 试验材料
用于本研究的水稻材料为武育粳3号，由江苏省（武进）水稻研究所提供。

1.2 菌株、载体及生化试剂
DH5α、EHA105购自天根生化科技（北京）有限公司，琼脂糖胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18－T载体、高保真Taq酶、各种限制性内切酶及T4连接
酶均购自大连TaKaRa。

表达载体pDX2181G由华中农业大学林拥军教授提供。

1.3 启动子克隆与载体构建
根据TWH1基因预测的结果和NCBI序列对比，在该基因翻译起始密码子ATG处及其上游2 442bp处设计并合成相应的PCR特异引物，上游引物为 LKL9－F，下游引物为LKL9－R，以武育粳3号总DNA为模板，用引物LKL9进行PCR扩增，PCR 反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45s，60℃ 60 s，72℃ 1.5 min，35 个循环；72℃ 10 min，4℃ 保存。

PCR产物回收后连接到pMD18－T载体，筛选
阳性克隆，送南京金斯瑞公司测序。

同时在引物LKL9末端引入HindⅢ和XmaⅠ酶切位点和保护碱基，重新合成引物LKL10，以启动子序列正确的重组质粒为模
板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，70℃ 60 s，72℃ 1.5 min，35 个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

PCR产物回收后重新连接到
pMD18－T载体，然后将克隆进T载体的启动子用HindⅢ和XmaⅠ双酶切，切
下的片段与pDX2181G载体的HindⅢ和XmaⅠ双酶切片段连接，得到TWH1
基因启动子与GUS基因融合的载体pTWH1／GUS。

然后经双酶切验证，用化学
转化法将鉴定为正确的质粒转到大肠杆菌DH5α菌株中，挑选阳性克隆提取质粒
直接转化根癌农杆菌EHA105，用于水稻转化。

1.4 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
采用武育粳3号为转化受体，水稻的组织培养及农杆菌转化法参照刘巧权等［9］的方法进行。

1.5 转基因材料的PCR检测
CTAB法提取水稻总DNA。

PCR扩增潮霉素抗性基因片段的引物序列为
HptF∶5′gatgttggcgacctcgtatt 3′，HptR∶5′gtgtcacgttgcaagacctg 3′。

扩增
目标片段大小为 414 bp，PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环；72℃10 min，4℃保存。

以质粒 pTWH1／GUS、武育粳 3 号分别作为阳性及阴性对照。

1.6 GUS 检测
水稻细胞中GUS报告基因的表达测定参照Jefferson等［10］的方法进行。

将水稻组织浸入含X－gluc的GUS染色液中，37℃保温过夜，之后用75%的乙醇脱
色至组织变白。

2 结果与分析
2.1 启动子的克隆与载体构建
以武育粳3号基因组总DNA为模板，用引物LKL9进行PCR扩增，获得长度为2 442 bp的片段（图1），将该片段克隆进pMD18－T载体中。

测序正确后以重
组质粒为模板用引物LKL10进行PCR扩增，PCR产物回收后重新连接到pMD18－T载体，然后将克隆进T载体的启动子用HindⅢ和XmaⅠ切下，连接到表达载体pDX2181G上相应的酶切位点中，构建启动子与GUS报告基因相融合的植物
表达载体pTWH1／GUS（图2）。

阳性对照载体采用pDX2181G（含35S启动子）。

启动子表达载体经HindⅢ和XmaⅠ双酶切鉴定正确（图3）。

图1 TWH1基因启动子PCR扩增结果
图2 表达载体构建示意图
图3 载体pTWH1／GUS的酶切鉴定
2.2 水稻遗传转化及转基因植株的获得
以武育粳3号成熟胚诱导的愈伤组织作为转化受体，经农杆菌介导的遗传转化方
法将含有TWH1基因启动子与GUS融合基因的表达载体pTWH1／GUS导入水
稻中。

经潮霉素B抗性筛选，选择生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化再生培养，
最终获得50株转基因植株。

根据潮霉素B抗性基因内部序列设计引物，以转基因植株叶片总DNA为模板，进行PCR检测，共有45株检测到414bp大小的目标
片段，PCR阳性率为90%。

图4显示部分转基因植株的PCR检测结果。

2.3 TWH1基因启动子组织或器官表达特性
启动子在各器官或组织中驱动GUS基因的表达情况反映了它所控制的基因在器官或组织中的表达特性。

为此，我们对4株T0代植株进行GUS组织化学染色分析。

结果表明，GUS基因在4个水稻转基因株系中表达特性相同。

水稻茎秆、叶片、
叶鞘、雌雄蕊GUS染色均呈阳性，孕穗期的颖壳也被染成蓝色，而相应植株的根和抽穗后的颖壳中未观察到GUS表达（图5）。

未转化对照植株的各组织器官均
未被染色。

图4 转基因植株潮霉素基因PCR检测
图5 转基因植株各组织的GUS染色
3 结论与讨论
1）对目的基因的启动子进行克隆和分析有助于研究基因的功能，本研究将TWH1基因的启动子与GUS基因融合构建的重组表达载体导入水稻愈伤组织中，通过对转基因水稻各个组织的GUS染色分析，从而了解TWH1基因的表达特性。

结果
表明，TWH1基因在各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳
中都有GUS活性表达，但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性。

说明
TWH1基因的表达具有时空特异性，我们将结合荧光定量分析法进行进一步的研究，以确定TWH1基因在颖壳中表达的具体时期。

2）为了研究最佳启动子区域，详细了解启动子结构区域的组成及其功能，我们克隆了TWH1基因启动子5’端缺失的不同片段，并得到4种不同长度的启动子片
段与GUS基因融合的植物表达载体，其遗传转化工作正在进行之中。

对该启动子及其基因功能的深度分析将有利于我们进一步了解该启动子在水稻基因工程上的应用潜力。

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