PCR扩增失败的原因分析
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR影响因素
影响PCR 结果得因素(1) 引物:引物就是PＣR特异性反应得关键,PCＲ产物得特异性取决于引物与模板DNA互补得程度、设计引物应遵循以下原则:①引物长度: １5－３０ｂp,常用为20ｂp左右。
②引物扩增跨度:以２00－500ｂｐ为宜,特定条件下可扩增长至10ｋb得片段、③引物碱基:G＋C含量以４0-6０％为宜,G+Ｃ太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。
ATGＣ最好随机分布,避免5 个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3'端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带。
⑤引物3＇端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适得酶切位点, 被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处、⑦引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性。
引物量: 每条引物得浓度０、1~1umoｌ或１0～１00pｍol,以最低引物量产生所需要得结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会。
(2)酶及其浓度目前有两种Tａq DNＡ聚合酶供应,一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶,另一种为大肠菌合成得基因工程酶。
催化一典型得PCR反应约需酶量2。
５U(指总反应体积为１00uｌ时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
(3)ｄNTP得质量与浓度dNＴP得质量与浓度与PCＲ扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTＰ溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MＮaO Ｈ或１M Ｔrｉs。
HCL得缓冲液将其PH调节到７。
0~7.5,小量分装, —20℃冰冻保存、多次冻融会使dNTP降解。
在ＰＣR反应中,dＮTＰ应为５0~２０0umｏl/Ｌ,尤其就是注意4种dNTＰ得浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
PCR常见问题
1. 2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 2+浓度偏高 Mg 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3. 4. 5. 6.
重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA DNA或加大模板的用量 模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer Buffer或调整浓度 2. 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（ 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 体和链内二级结构） 管新引物 降低退火温度、 4. 降低退火温度、延长延伸时间
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶 聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 增强剂
PCR Master Mix
特 点
快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 可扩增低至2 特异性强 稳定性好 降低PCR反应的要求， 降低PCR反应的要求，增强特异性 PCR反应的要求 长期放置活性无改变
是除了好的引物设计之外， 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性 最重要的方法之一。 最重要的方法之一。
策略之四
使用PCR增强剂
甲酰胺， 的增强剂。 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当 ，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 的增强剂
其可能的机理是降低熔解温度， 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅 助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当
PCR影响因素
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。
样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。
酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
一、PCR反应的关键环节1. 模板核酸的制备。
2. 引物的质量与特异性。
3. 酶的质量。
4. PCR循环条件。
二、PCR常见问题及对策1. 假阴性，不出现扩增条带（1）模板原因①模板中含有杂蛋白质。
②模板中含有Taq酶抑制剂。
③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。
④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
分子实验——影响PCR扩增因素的分析
分子实验——影响PCR扩增因素的分析PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术，用于扩增目标DNA片段。
PCR扩增的效果受多种因素的影响，下面将对影响PCR扩增的因素进行分析。
首先是引物设计。
引物是PCR扩增的关键，它们在PCR反应中起到引导DNA合成的作用。
引物的设计需要考虑多个因素，包括引物长度、碱基互补性、引物浓度以及引物之间的相互作用等。
引物的长度应该在18-30个碱基对之间，太短会导致非特异性扩增，太长则可能会影响扩增效率。
引物的碱基互补性要求较高，避免自身结合形成二聚体或多聚体，影响PCR反应。
引物的浓度也需要优化，过高的浓度可能会导致引物的非特异性结合，而过低的浓度则可能会影响扩增效率。
此外，引物之间的相互作用也应该考虑，避免引物之间的二聚体或多聚体形成，会导致非特异性扩增。
其次是反应条件。
PCR反应需要一定的温度和时间条件。
PCR反应的温度包括变性温度、退火温度和延伸温度。
变性温度用于将目标DNA变性为单链DNA，一般设定为95℃，时间为1-5分钟。
退火温度应该合适，使引物与模板DNA特异性结合，一般设计退火温度为5℃低于引物的结合温度，时间为30-60秒。
延伸温度用于合成新的DNA链，一般推荐为72℃，时间根据目标片段长度决定，一般为每kb1-2分钟。
另外，PCR反应的循环次数也需要优化，过多会增加非特异性扩增的风险，过少则可能无法达到预期的扩增效果。
第三是DNA模板的质量和浓度。
DNA模板的质量和浓度对PCR扩增的效果有重要影响。
模板DNA的质量应该尽可能纯净，避免有附带的细菌DNA、RNA或PCR抑制物等。
有时，模板DNA的浓度也需要优化，过高或过低的浓度都可能会影响扩增效果，一般推荐的DNA浓度为10-100ng。
第四是酶的选择和浓度。
PCR扩增需要用到聚合酶，常用的酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
Taq聚合酶具有耐高温的特性，适用于PCR反应的变性和延伸步骤，但是它的扩增精确度较低，容易引起突变。
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。
3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于物污染，就可形成假阳性。
反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCRPCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的产物拷PCR 产4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR常见问题的常见原因
1. cDNA产量的很低可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。
由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。
在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。
分子实验常见问题
分子生物学实验常见问题分析及对策一、各种常见PCR1.PCR反应扩不出条带，出现假阴性，可能原因：（1）模版：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，且含量低；Buffer 对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。
引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（5）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
pcr常见问题复分析
PCR常见问题分析来源：杨洋的日志PCR在产物序列中引入了错误？参考见解：1 聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2 循环数太多：降低循环数。
3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。
一步法和两步法有什么区别吗？`参考见解：其实一步法并非是两步法的改进，根据实验目的不同，有时两步法会更好。
举个例子，如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因，那么一步法是从RNA开始的，即分别取相同量的RNA，然后逆转录，然后加入不同的primer PCR，方法固然简单，但逆转录酶很贵。
如果两步法，可将RNA逆转录为cDNA，然后每次加入相同量的cDNA，再加不同的引物PCR，这样可比性强，而且不需逆转录，直接PCR即可。
当然，如果想快速获得某一种基因，当然一步法好。
所以一步法和两步法各有优点，不能一概而论。
PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象，请教各位是什么原参考见解1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。
模板的质量是最重要的。
2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提3提高退火温度，减少非特异性扩增。
4减少循环次数，减少非特异性扩增。
5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变6电泳时电压不能太高，8V/cm。
7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。
8 加样量过大。
过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
9制胶过程中胶孔没制好。
10 EB没有冲洗干净。
11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。
12非特异反映。
引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。
13电泳液用久了不换，电泳胶脏了。
14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。
PCR实验常见问题
【实验】PCR常见问题总结作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
一.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR错误分析
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
温度循环参数 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s,72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。
在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。
下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。
变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。
一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。
DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
pcr样本浓度太高,扩增曲线不好的原因
pcr样本浓度太高,扩增曲线不好的原因
当PCR（聚合酶链式反应）样本浓度太高时，可能会导致扩增曲线不好的原因有以下几个：
1. 抑制效应：高浓度的样本可能会抑制PCR 反应。
过多的模板DNA 会与引物和聚合酶竞争，从而影响反应的效率和特异性。
2. 非特异性扩增：高浓度的样本可能导致非特异性扩增的增加。
过多的模板DNA 可能引发不必要的扩增，产生杂带或非目标产物，从而影响扩增曲线的质量。
3. 引物二聚体形成：高浓度的样本可能增加引物二聚体的形成。
引物之间可能相互结合，形成非特异性的双链结构，从而干扰正常的扩增反应。
4. 反应平衡问题：高浓度的样本可能导致反应体系中的各种成分之间的平衡受到影响。
这可能影响到聚合酶的活性、引物的结合以及扩增产物的形成。
为了解决这些问题，可以尝试以下方法：
1. 稀释样本：将高浓度的样本进行稀释，以降低模板DNA 的浓度。
这样可以减少抑制效应和非特异性扩增的发生。
2. 优化反应条件：根据具体情况，调整PCR 反应的条件，如引物浓度、聚合酶用量、退火温度等，以提高反应的特异性和效率。
3. 设计特异性引物：确保使用的引物具有高度的特异性，以减少非特异性扩增的发生。
4. 控制样本质量：确保样本的质量和纯度，避免杂质对PCR 反应的干扰。
影响PCR 结果的因素
影响PCR 结果的因素(1) 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
(2)酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
(3)dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
荧光定量pcr扩增曲线异常的原因
荧光定量pcr扩增曲线异常的原因一、前言荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、快速、准确的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、药物筛选等领域。
在qPCR实验中，扩增曲线是评价实验质量和数据可靠性的重要指标之一。
然而，在实验过程中，有时会出现扩增曲线异常的情况，影响实验结果的准确性和稳定性。
本文将从样品、引物和试剂等多个方面探讨荧光定量PCR扩增曲线异常的原因，以期帮助读者更好地解决实验中遇到的问题。
二、样品相关原因1. 样品质量差：样品质量差可能导致扩增效率低下或者抑制扩增反应。
例如，样品含有抑制剂（如血红素），或者含有大量的DNA酶或核酸酶等会降低扩增效率。
2. 样品浓度太高或太低：过高或过低的样品浓度可能导致扩增曲线异常。
当样品浓度过高时，可能会发生内部吸收效应，使得荧光信号饱和，导致扩增曲线饱和或者偏离标准曲线。
当样品浓度过低时，可能会导致荧光信号过弱，使得扩增曲线平缓或者不明显。
3. 样品来源不同：不同来源的样品可能存在差异性，如组织、血清、唾液等。
这些差异可能影响反应的特异性和灵敏度，导致扩增曲线异常。
三、引物相关原因1. 引物设计不合理：引物序列设计不合理可能导致扩增效率低下或者特异性差。
例如，引物长度太长或太短、引物序列含有重复序列或GC 含量过高等都会影响PCR反应的特异性和效率。
2. 引物浓度过高或过低：引物浓度过高可能会导致非特异性放大和二聚体形成等问题，而引物浓度过低则会降低PCR反应的效率。
3. 引物质量差：引物质量差可能会导致PCR反应效率低下或者特异性差。
例如，引物受到污染、降解等都会影响PCR反应的稳定性和可靠性。
四、试剂相关原因1. Taq酶质量差：Taq酶是PCR反应中最重要的试剂之一，其质量直接影响PCR反应的效率和特异性。
如果Taq酶质量不好，可能会导致PCR反应效率低下或者特异性差。
2. dNTPs浓度不合适：dNTPs是PCR反应中必不可少的试剂之一，其浓度对PCR扩增曲线的形态有重要影响。
PCR异常扩增曲线分析
PCR异常扩增曲线分析1. PCR正常扩增曲线随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如40个循环），就可以得到下面的扩增曲线图（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。
这其中还需要弄清楚一些基本概念，如：基线：指在PCR扩增反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大。
接近一条直线，该直线叫做基线。
这个了解即可，对实验操作没什么影响。
阈值线：一般来说，前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值的设定就是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，在PCR扩增的指数期（如图中箭头所指）。
说的这么严肃，其实很多仪器自动设定的阈值线基本能够满足我们的实验要求，不需要我们手动设置的。
CT值：我们常会用CT值来计算我们的相对含量，即扩增产物的荧光信号到达设定的阈值线时所经历的扩增的循环数，也就是图中扩增曲线和阈值线的交汇处的横坐标所显示的值。
2. 标准曲线做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。
如果是需要绝对定量，是必须要有标准曲线的。
怎么做呢？每个模板的CT值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系的，起始的拷贝数越大，CT值就越小。
标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，根据RT-PCR的反应条件进行反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。
而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。
那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？（1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一些，但结果也更加精确。
要求：必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA，纯化后的PCR产物等），5-6个稀释梯度；PCR反应仪器要同一种，并且同时操作；反应的条件一致：反应体系、参数等等；反正能一致的都一致就对了。
（2）如果只是想看看扩增效率（E）（E=10-1/斜率），检验PCR的反应体系是否符合要求，我们有时候也采用待测试样品作为标准品，逐步稀释后进行反应，最终看标准曲线的斜率和R2是否符合要求，我比较懒，常会用这种方法，不过有些发文章的要求会比较高，那还是要乖乖去做的。
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PCR扩增失败的原因分析2010-12-13 16:48:31| 分类：|字号订阅PCR扩增失败原因分析，PCR产物电泳2010-05-15 16:07一模板质量问题：1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。
可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。
如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。
2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。
3）为什么跑电泳会出现拖带呢？1. 有可能的因为你的电压调的太高了。
电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。
你可以适当的调低点看看。
2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。
你看能否回收之后，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。
二引物问题1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。
也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。
可以换一对更保守的引物试试。
祝顺利！2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。
如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。
在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的三 Taq酶处于失活状态。
因为活性降低了能出现二聚体。
tap酶种类高特异性Taq酶高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。
这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。
大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。
而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。
第一代热启动Taq酶往往直接在Taq 酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI 的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。
新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。
此外，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。
此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。
如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR 反应。
另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTMTth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。
高保真Taq酶下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR 保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。
普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。
其原理主要是因为高保真Taq酶具有3'到5'核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。
需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法。
目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。
Clontech、LTI等公司都有此类产品。
如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4×10-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。
高耐热性Taq酶对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。
超长片段扩增Taq酶对于作图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading 酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。
关于复杂模板的扩增对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。
QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。
关于条件的优化现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。
但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。
以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。
我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。
四.模板浓度过低。
五、.退火温度过高。
有可能，可以做个梯度PCR试一下。
六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。
这个可能性不大。
七、dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。
当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg 的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
八、PCR产物电泳1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。
换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。
marker都出问题说明是你的胶的问题，或者电泳操作的问题。
2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
如下图：其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
3.如何获得亮的电泳条带PCR反应前5个循环可以降低退火温度5°，后面30-35个循环恢复正常退火温度。
也可以以第一次PCR的产物作为二次PCR的模板。
常见问题具体情况可能的原因处理办法备注测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。
在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。
因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。
在序列的起始端有时会有一些N值。
该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
现在公司已采取了有效措施，序列起始区的信号已大为改善，有时几乎第一个碱基就可以正确读出，染料的干扰问题基本解决。
但是客户提供的PCR引物用于测序时，有时会产生引物二聚体，对测序的起始区造成干扰。
在序列的3’端容易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基，但是，只有550bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp 的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值，这种情况下产生的N值是无法避免的。
现在我们只承诺正常情况下每个测序反应至少读出500个碱基的有效序列。
测序模板本身含有杂和序列，该种情况主要发生在PCR产物直接测序上。
由于PCR产物本身有突变或含有等位基因，就会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
可以很容易判断该种情况，那就是整个测序信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂和度不同N值可能有多有少。
该种情况明显是客户的样品问题。
通过将PCR产物克隆后进行测序，可以解决该种情况的N值问题。
由于模板质量问题或测序不好，所得的序列结果较差，也会产生许多N值。
一般情况测序结果不好的，我们都会根据具体原因尽量加以解决。
有些实在无法解决的也就没有办法了。
针对有N值的情况，我们一定要根据具体情况具体分析。
很多情况下是客户自己的模板原因造成N值，在这种情况下我们没有必要为客户承担测序失败的损失。
有许多情况下由于客户的原因造成的测序失败，我们至少要让客户知道是客户本身的原因而不是我们的技术问题。
我为什么找不到我的PCR引物？以下几种情况，我们将无法找到做PCR时的引物序列：用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。