柱效检测-Application 28-9372-07 AA
一种新的气相色谱柱效测量方法
P G-0 ,S i ai 担 体 6 ~8 目,A自动打 印。
结 果 与 讨 论
根据同系物碳数与调正保留时间的对数呈线性 关系,可由等距离碳数的三个同系物的保留时间计 算死时间(M[] t)4。
仪器 GC 9 气相色谱仪,F D 检测器, -A I C R2 色谱数据处理机,均为日本岛津公司制。 - A 色谱条件 检测器和注入口温度 20 0 ℃,载气 高纯氮气。 色谱柱:玻璃毛细柱 , 2 × 4 壁涂 p. 3米, 3 3 V-7 %O 1,玻璃填充柱 φ.×1 3 2 . 6米,涂渍2% 5
[ 6] J. a De t e a,C e .E g c . V n me t hm n.Si J e r l . . , 5 211 6. , 7( 5) 9
( 收稿 日期:18 年1 月9日) 95 0
《 国外分析仪器—技术与应用—》刊号变动启事
《 色谱》18年第4 96 卷第4 5页曾载 《 期28 国外分析仪器—技术与应用—》征订启事一则,该刊 编 辑
式中 nn i定义为容量比 ( 无穷大时的理论板数。 e K) 注脚 为ifnt C pcy nii aa t,从图 1明显 看 出, e i nn i与容量比 ( 无关。从而解决了色谱柱效相互 f K)
比较 的困难 。
式中C 为比例常数 根据t. *计算塔板数: R
nn 及 其测算方法也适用于填充柱。其半 峰 i f 宽与保留时间的线性关系也见图( ) 2 。但外推至时 间轴上的截距( ) t 则为负值,这与填充柱理论塔板 c 或有效塔板随容量比( 增加而增加相一致,填充 K) 柱柱效与各影响因素的关系可由范氏方程描述[] 6;
[ ] J Cu m n J C rm t rSi 2,9 3 a el as . ho a g c,226 n e , o. . 一股说 分于越复杂,保 留时间越 长,气相扩 散系数 羰
液相增加柱效、提高灵敏度的小诀窍
流动相对色谱的影响(TE40) 色谱柱技术 –流动相对色谱的影响 流动相对色谱的影响
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-C8 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 50 mm 3.5µm
0.025 M H3PO4
流动相: 流动相 A: 含相应的酸的水相 B: 含相应的酸的乙腈 0%-30% B(30 min.内) ( 内 进样量: 进样量 6µL肽标样 肽标样 UV: 254 nm 流速: 流速 1 mL/min 40°C ° 改变有机添加剂 可增加柱效 (提高灵敏度) 提高灵敏度)
温度: 温度 检测器: 检测器 样品: 样品
减小柱径,可增 减小柱径, 加柱效( 加柱效(提高灵 敏度) 敏度)
色谱柱技术 – 5988-6454EN 使用小体积色谱柱对于检测器 响应时间的重要性 (TE32)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-C18 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 15 mm 3.5µm
色谱柱技术 – 5988-6468EN 有机改性剂和pH对于选择性的影响 有机改性剂和 对于选择性的影响 (TE5)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-CN 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 150 mm 5µm
甲氧基苯胺 间位苯甲胺 4-氯-苯胺 3-氨基苯甲腈 3-氯-苯胺 2-氯胺 改变有机相%, 改变有机相 , 可增加柱效 提高灵敏度) (提高灵敏度)
提高柱温, 提高柱温, 可增加柱效 提高灵敏度) (提高灵敏度)
生物制药 减小毛细管内径来提高 低浓度样品的检测灵敏度 Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity for Concentration-Limited Samples
认可证书
Code of field 1001
Name, Code of Specification, standard or method used Test method for fineness of cement-The 80μm sieve GB 1345-2005 Method of testing cements-Determination of strengthGB/T 17671-1999 Accelerated Test Method for Cement Strength JC/T738-2004 Method for chemical analysis of cement GB/T 176-1996 Portland cement and ordinary Portland cement GB 175-1999
Code of field Name, Code of Specification, standard or method used Restriction or limitation and others
Items, parameter, types of tests № Name
Products and materials for construction
4
all items
1001
Composite Portland cement GB 12958-1999 Masonry cement GB/T3183-2003 Alunite Expansive Cement JC/T311-2004 Method of Physical Test for Self-stressing Cement JC/T453-2004 White portland cement GB/T2015-2005 Gypsum Plaster JC/T517-2004
高效液相色谱仪确认方案
高效液相色谱仪(岛津LC-2010AHT)确认方案(方案编号:zl-08-2013)目录1. 确认方案审批表2.概述3.确认目的4.确认范围5.人员职责6.相关文件7.仪器、仪表校验8.确认计划与进度9. 确认步骤9.1运行确认(OQ)9.2性能确认(PQ)10.偏差处理记录11. 确认结果评定与结论12.再确认项目及检查周期13.确认人员培训14.附件1.确认方案审批起草审核批准2.概述2.1设备基本信息●设备名称:高效液相色谱仪●设备型号:LC-2010AHT●国别:日本●厂名:岛津2.2设备系统描述设备结构:LC-2010AHT是主要由4液低压梯度、自动进样器、柱温箱、UV检测部组成的一体型高效液相色谱仪,外接RID-10A型示差检测器、打印机和稳压电源,各部分的操作均可由工作站或液晶控制面板控制。
●工作原理:LC-2010AHT检测步骤主要包括流路清洗、色谱柱平衡及检测器平衡、样品处理、自动进样程序设定、自动进样、后处理及数据处理等,LC-2010AHT根据不同色谱柱对样品在色谱柱内的保留时间不同,用流动相将样品通过色谱柱洗脱,再通过适合的检测器对洗脱的样品成份进行分析。
●设备用途:低分子量肝素钙及立迈青、小牛血去蛋白提取物及睿保特、干扰素原液、肝素钠和部分原辅料等相关项目的定性、定量分析检验。
2.3设备技术参数2.3.1输液泵方式设定输液泵参数时,请参照以下参数表:[ISO.方式]:[GRAD.方式]2.3.2柱温箱和外围设备设定柱温箱和外围设备的参数时,请参照以下的一览表:2.3.3 UV-VIS检测器设定UV-VIS检测器的参数时,请参照以下的一览表:3.确认目的为确认LC-2010AHT高效液相色谱仪检测数据准确可靠,性能稳定,特制订本确认方案,对LC-2010AHT高效液相色谱仪进行确认。
4.确认范围本方案适用于LC-2010AHT高效液相色谱仪的运行和性能确认。
5.人员职责6.相关文件《中国药典》2010年版二部《中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪(JJG705-2002)》《高效液相色谱法标准操作规程》《高效液相色谱仪使用维护规程》《高效液相色谱柱使用维护规程》《注射用低分子量肝素钙标准操作规程》《岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪操作说明书》《文件检查记录》见附件一7. 仪器、仪表校验验证前对验证过程中涉及到的仪器仪表等检验仪器进行确认,保证其在有效期内。
柱效检测-Application 28-9372-07 AA
平均停留时间* 方差* 停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 一个理论塔板的等价高度 折合的塔板高度
脉冲检测
脉冲功能是检测使用的最为常见的信号类 型。 将小体积的示踪物质加入靠近层析柱入 口的液流时, 这一展宽的脉冲信号在层析柱 出口处分析时呈现为色谱图上的谱峰。 典型 的脉冲反应和它的评价在图 1 中给予了总 结。 柱效通常被认为包括两个参数: 整个层析柱的峰展宽情况通常用等价 数量的理论塔板数进行描述(平衡阶 段) 峰对称性通常用峰对称性 As 进行描述。
然而这样会使得装柱过程的各种缺陷进行 观察和纠正的难度有所增加, 并且会导致层 析柱和层析系统构建不当增多。 适宜检测条件的选择 理论上来说, 生物过程应用中使用有孔层析 介质时,当塔板高度通常在 h=1.5 到 2 之间 时往往能获得最佳柱效。 这套理论柱效是通 过范德姆特分析衍生而出, 反应出最佳检测 环境下(即液体流速)填充床内的对流和扩 散分散效应。 其余的峰扩散来源主要包括了 柱床装填不均一,层析柱液流分布不均匀, 系统效应以及样品体积等因素。 为了给层析 柱设定适宜的参数(也为了解决问题) ,需 要对这些导致峰展宽的原因进行严加控制, 这样才能定义影响理论塔板数柱效的基准。 示踪物质 示踪物质的选择需要保证物质大小(分子 量)能完全渗透进入层析介质的孔隙结构 内。 必须避免示踪物质与层析介质发生表面 相互作用, 以保证示踪物质是化学惰性和稳 定的。此外,洗脱成分和样品的粘度和密度 差异应降低至最小, 以避免由不稳定流动模 式(粘度指纹效应)造成的系统误差。 通常使用的,能符合这些要求的样品/ 洗脱 系统为水-丙酮和盐系统,这些系统可分别 通过测定吸收值和电导进行监测。 根据层析 介质的化学属性,推荐以下样品和洗脱液: 对于除疏水合成聚合物,RPC 和 HIC 介质 以外的所有介质: 洗脱液:水 样品:1 -2% 丙酮水溶液 对 RPC 和 HIC 而言: 洗脱:20%乙醇 样品:1 -2%丙酮,至少 20%的乙醇 对于所有介质: 洗脱:0.4 M NaCl(溶于水) 样品:0.8 M NaCl(溶于水) 当使用 NaCl 作为示踪剂时,洗脱液中至少 要用 0.4 M NaCl(35 – 40 mS/cm)对示踪剂 和层析介质之间的电荷相互作用进行有效 地抑制 (否则可能会导致不恰当的检测结果 发生) 。当时用的示踪物质与介质发生相互 作用时,峰对称性受到破坏,这一例子见图 2
GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解
GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作,对于定量表征层析柱的工作状态是否良好,工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况,不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法,以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分,测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备:⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配,从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小(管路内径尽量细,管路尽量短),这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV(柱体积),平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统:1 NaCl 测试系统;2 丙酮测试系统。
只要操作正确,两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意:各试剂的浓度不能随意改变,否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料,都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液: 0.4 M NaCl水溶液样品: 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV,将1% CV的样品(NaCl或丙酮)注射进入层析柱,使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作(各UNICORN版本操作基本一致)。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线,以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线(手头没有测柱效结果,所以随便找了一个图,里面有两个峰。
大家测柱效的结果只有一个峰)1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件,在Curve窗格中点击右键,选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮,进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置,基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window,出现以下窗口,通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围,点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义,包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等,在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数,点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度,在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮,可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK,查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键,选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据, plate height(HETP)、Asymmetry 等,点击OK执行。
霍尼伟尔气体侦测器中文说明书
HoneywellAnalytics©2004 Honeywell Analytics Issue 1 12/2004 MIDAS-A-001目录1 目录 22 概述 53 产品概述 5 3.1 主机架 6 3.1.1 显示器模块 63.1.2 泵模块 7 3.1.3 传感器暗盒腔 73.2 安装托架底座 73.2.1 安装托架 73.2.2 终端模块 73.3 传感器盒 83.3.1 偏致传感器盒 83.4 机壳 84 默认配置 95 安装95.1 探测器的安装和定位 105.2 机械安装 115.3 样品和排气管道计算 125.4 在线过滤器 135.5 本地化探测器选购件 145.6 电气安装 155.7 电连接 17 5.8 改装主机架 185.9 安装传感器盒 196 探测器启动程序 197 总体操作 21 7.1 正常操作模式 217.1.1 重置报警、故障和维护故障 227.2 浏览模式 227.2.1 浏览模式菜单概述 237.3 设置、校准和测试模式概述 247.3.1 设置菜单概述 247.3.2 校准菜单概述‘CAL’ 267.3.3 测试菜单概述‘ tESt’ 278浏览、设置、校准和测试模式子菜单的导向的详细程序 288.1 浏览模式 288.1.1 复查软件‘SW’ 288.1.2 复查报警‘ ALm’ 298.1.3 复查故障‘ FLt’ 298.1.4 复查校准 ‘ CAL’ 298.1.5 复查日期和时间‘timE’ 298.1.6 复查探测器地址‘ nEt’ 308.1.7 复查事件标识‘ Hi St’ 308.2 设置、校准和测试模式 308.2.1 设置菜单‘ SEt’ 318.2.2 设置报警‘ ALm’ 318.2.3 设置故障‘ FLt’ 348.2.4 设置校准间距 ‘ CAL’ 348.2.5 设置日期和时间 ‘timE’ 558.2.6 设置地址‘ nEt’ 358.2.7 设置密码 ‘ PWd’ 368.3 校准菜单‘CAL’ 368.3.1 零点校准 ‘ 0CAL’ 368.3.2 间距校准‘ SPAn’ 378.3.3 流量校准‘ FLoW’ 388.3.4 mA 校准 ‘mA 4-20’ 388.4 测试菜单‘ tESt’ 398.4.1 颠簸测试 ‘ bUmP’ 398.4.2 报警/故障测试‘ Si m’ 398.4.3 禁止状态‘ I nH’ 409 常规维护 41 9.1 传感器盒的更换 419.1.1 传感器盒的安装/更换 419.2 泵的更换 43 9.3 重新组装探测器 469.4 过滤器的更换 4610 热解器模块选项 4710.1 安装热解器模块 4810.2 重新组装MIDAS® 探测器 4911 模拟输出模块 51 11.1 安装模拟模块 5111.2 重新组装MIDAS® 探测器 5212 找出故障并诊断 5313 REFLEX®ٛ5414 内置的网络服务器 5414.1 物理的网络组件 5414.2 网络设置 5414.3 运行网络浏览器 5415 典型安装拓扑 5615.1 常规安装 57 15.2 Modbus/TCP 安装 5715.3 通过以太网供电(POE) 的安装 5716 订购信息 58 16.1 MIDAS® 发送器 5816.2 MIDAS®热解器 5816.2 MIDAS® 热解器 5816.3 MIDAS® 模拟输出模块5816.4 MIDAS®插入式传感器盒(标准保修期) 5916.5 MIDAS®插入式传感器盒(延长保修期)6016.6 完整的MIDAS®气体探测器套件 6116.7 附件及备件 6117 一般规格 6218 校准及颠簸测试 6319 保证声明6720 软件菜单叙述图表 6920.1 高级6920.2 浏览模式7020.3 复查软件的信息、报警、故障及气体校准7120.4 复查日期/时间和网络7220.5 复查事件日志7320.6 设置模式7420.7 设置报警、故障及气体校准 7520.8 设置日期/时间和网络7620.9 设置密码7720.10 校准模式7820.11 校准气体零点及间距7920.12 校准——流量校准 8020.13 校准——4-20 mA 8120.14 测试模式8220.15 测试颠簸、报警/故障模拟 8320.16 测试禁止8421 联系详情 852 概述作为一个提取式气体取样系统,MIDAS气体探测器能在本地或从一个远程点提取一个样品到位于探测器机架内的传感器盒。
色谱柱常见故障_2022年学习资料
解决问题-可能原因-解决办法-出现肩峰或-预柱被污染或选用了不合适的预柱更换预柱-前延峰-柱头“塌陷”造成 体积或是-更换色谱柱-柱子内部有短流出现-溶解样品的溶剂选择错误-用流动相溶解样品-改进样品预处理;用测试 混合物-干扰物质的存在;样品中的杂质-检验色谱柱;使用色谱纯溶剂-色谱柱过载-将样品稀释-柱外效应的影响查连接色谱柱入口端的管道-三
色谱柱故障排除-人-J人-aml门-hmmjm
色谱柱的组成-·主要部件:柱管、柱头、筛板-·故障特征-1.色谱峰形不好-2.柱压高
色谱柱-避免问题的-·使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)-·大多数反相色 柱的pH稳定范围是2-8.0-•避免流动相组成及极性的剧烈变化-•流动相使用前必须经脱气和过滤处理-•如果 用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕将柱子冲洗干净,-并保存在乙腈中-•压力升高是需要更换预柱的 号
解决问题-减少样品体积;-色谱柱过载-增大色谱柱内径;-出现脱尾峰-使用高容量的固定相-改进样品预处理;扰峰;杂质-调节流动相的组成;-使用测试样品混合物检查色谱柱;-使用色谱纯溶剂-使用流动相改性剂(如三乙胺 ;-硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响提高缓冲溶液或盐溶液的浓度(离子对色谱)-降低流动相的pH值;-使用碱 去活的色谱柱-色谱柱的滤网堵塞-更换滤网;使用柱前过滤系统;-将样品过滤-柱外效应的影响;-检查管路连接体积-色谱柱有“塌陷”、短流或断流-更换色谱柱;-使用性质较温和的分离条件
解决问题-可能原因-解决办法-色谱柱或预柱被污染或不合适-更换色谱柱或预柱-峰形展宽-色谱柱“过载”或进样 积过大-减少进样体积;稀释样品-溶解样品的溶剂选用不当-用流动相溶解样品-缓冲溶液的浓度太稀-使用浓度稍高 缓冲溶液或者-换用其它的缓冲溶液-色谱柱和检测器之间有漏;-检查是否有漏;使用小的检测池-检测器的检测池过 -色谱柱温度太低;-提高色谱柱温度-流动相的黏度太高-柱外死体积太大-检查柱外死体积-色谱柱柱效下降-使用 小粒径填料的色谱柱;
柱效测定
柱效测定是一项经常使用的操作,对于定量表征层析柱的工作状态是否良好,工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况,不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法,以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分,测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备:⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配,从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小(管路内径尽量细,管路尽量短),这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV(柱体积),平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统:1 NaCl 测试系统;2 丙酮测试系统。
只要操作正确,两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意:各试剂的浓度不能随意改变,否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料,都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液:0.4 MNaCl水溶液样品:0.8 M NaCl水溶液⑵丙酮测试系统对于亲和、离子交换和凝胶过滤技术的层析柱和填料平衡液:水样品:1%丙酮的水溶液对于反相和疏水层析柱和填料平衡液:20%乙醇样品:1%丙酮溶于20%乙醇3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV,将1% CV的样品(NaCl或丙酮)注射进入层析柱,使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作(各UNICORN版本操作基本一致)。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线,以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线(手头没有测柱效结果,所以随便找了一个图,里面有两个峰。
气相填充色谱柱的柱效测定(精)
气相色谱填充柱的柱效测定一、 实验目的1. 了解气相色谱仪的基本结构和工作原理2. 学习气相色谱仪的使用3. 学习、掌握色谱柱的柱效测定方法二、 基本原理色谱柱的柱效能是色谱柱的一项重要指标,可用于考察色谱柱的制备工艺操作水平以及估计该柱对试样分离的可能性。
在一定色谱条件下,色谱柱的柱效可用有效塔板数n 有效及有效塔板高度h 有效来表示。
塔板数越多,塔板高度越小,色谱柱的分离效能越好。
有效塔板数及有效塔板高度的计算公式如下:2'221')(16)(54.5Y t Y t n R R ==有效 有效有效n L h =M R R t t t -='式中:R t 为组分的保留时间。
'Rt 为组分的调整保留时间。
M t 为空气的保留时间(死时间)。
Y 1/2为色谱峰的半峰宽度。
Y 为色谱峰的峰底宽度。
L 为色谱柱的长度。
由于不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同,因而同一色谱柱对不同组分的柱效也不相同,所以在报告n 有效时,应注明对何种组分而言。
三、 仪器和试剂1. 气相色谱仪(热导检测器)2. 填充色谱柱(固定相:SE-30;担体:硅烷化白色担体;柱内径:3mm ;柱长:2m )3. FJ-2000色谱工作站4. 微量进样器:50μl5. 注射器:2ml6. 载气:氮气7. 试剂:正己烷、正庚烷、正辛烷均为分析纯(体积比1:1:1)四、 实验步骤1. 开启仪器,设定实验操作条件。
按气相色谱仪器操作步骤开启仪器。
设定柱温为80℃,汽化室温度为150℃,检测器温度为110℃,载气流量为10-15ml/min 。
2. 开启色谱工作站,进入数据采集系统。
按照色谱工作站操作步骤开启计算机,进入色谱工作站,监视基线,待仪器上的电路和气路系统达到平衡,基线平直时,即可进样,同时记录数据文件名。
3. 测定试样的保留时间R t 。
用微量进样器吸取3μl试液进样,记录试样色谱图文件名。
柱压问题 文档
色谱柱在HPLC中是非常关键的部件。
一台色谱仪如果没有色谱柱几乎什么工作也做不了。
色谱柱是消耗品,有一定寿命,使用中也非常容易出问题。
普通的正相反相色谱柱使用得当可用一、两年。
使用不得当用两、三个月就可能损坏。
所以使用中应该非常注意。
1.在使用一根新的色谱柱之前,一定要看柱说明书,将柱子的使用压力、pH值、温度范围和所用流动相种类都要弄清楚。
接触最多的是C18色谱柱,它对试剂应用的范围非常广,甲醇、水、乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、正乙烷、各种缓冲盐都适用。
但其他的色谱柱所使用的试剂就有一定的要求,有的色谱柱只能使用水,不能使用有机试剂,有的色谱柱只能使用有机试剂,而且使用指定是某一种,象GPC色谱柱。
这些事情一定搞清楚,如果流动相使用不对,柱子很快会损坏。
另外在更换柱子时不能让不能使用的流动相进入柱子。
2.柱子是有方向的,柱子上箭头的方向就是流动相流动的方向。
当换新柱子时,不要马上就接到检测器上使用。
将柱子入口处接在进样器的出口,柱子出口处(即箭头的一端)先不接检测器,按箭头方向垂直朝上,用流动相(甲醇)以1ml/min的流速冲洗1min左右。
将柱子里的小气泡全部赶走以后再接到检测器上,否则小气泡跑到检测池里,就很难赶走,检测器产生噪声信号,基线也就走不好。
3.关于压力对色谱柱的影响:常用的正反两相色谱柱一般耐压在12~20MPa之间,生产厂家不同,耐压也不同,从理论上讲耐压高的色谱柱柱效就高,但柱效高低不仅与耐压的高低有关,还有其他因素。
从使用中看,在保证柱效的同时,耐压不要太高,仪器所显示的压力是流路、混合器、自动进样器、柱压、流通池总体的压力,检查柱压力应分段检查。
压力过高不仅柱子受不了,其他的部件也会出问题,例如自动进样器。
4.色谱柱对pH值是有一定的使用范围。
以硅胶为担体的柱子一般使用范围在2~7pH。
耐碱性能不太好,流动相的pH大于8会使硅胶溶解。
有些分析条件须用碱性流动相,这时一定要选耐碱性好的色谱柱,流动相的PH值过高或过低,流动相使用纯水,使用高浓度磷酸盐缓冲溶液,使用离子对试剂等,均可能造成色谱柱填料被化学破坏,这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的。
Agilent-34972A操作说明
Agilent 34972A数据采集器操作阐明
2)多路多功能复用器模块;
Agilent 34972A数据采集器操作阐明
2)多路多功能复用器模块;
配置通道(选择你测试旳内容与连接待测点保持一致)
Agilent 34972A数据采集器操作阐明
扫描设置
Agilent 34972A数据采集器操作阐明
输出设置内容旳图表
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其他旳例图
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停止扫描
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示精度0.1 ℃)。 7.再按Measure键,即可完毕设置并退出。
其他各通道配置类似上述操作,详细环节略。 8. 配置各通道后,按Scan按钮开始扫描。 9. 按View按钮,再经过旋转旋扭,直到显示屏出现READINGS (读数)。 10. 按View按钮(表达拟定),即可在显示屏上看到刚刚扫描得到旳读数,经过旋转旋扭,能够看到各
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Agilent 34972A背面板接口
Agilent 34972A数据采集器操作阐明
1) Agilent 34972A数据采集器
打开电源开关按钮,设置各通道配置:(以J型热电偶配置为例)
1.用 左右选项按钮 和旋转按钮、旋扭选择101通道(在显示屏旳CHANNEL框中显示出该通道为止); 2.按Measure键,再经过旋转旋扭,直到显示屏出现TEMPERATURE(温度)。 3.再按Measure键(表达拟定并继续设置),再经过旋转旋扭,直到显示屏出现THERMOCOUPLE(热
柱效测定以及影响因素
速度(cm/h) 60 60 30
20 20
10
3.样品体积 柱效柱效测试通常使用的样品体积为 1%的柱体积(Vc)。当某些硬件条件无法满足时,可以在经验范围内
迚行微小优化以加强对示踪物质的检测能力。然而,值得一提的是,对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导 致色谱峰明显加宽,降低塔板数,这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。由于峰宽增大,峰对称性可能有 所改善。这一点与增加检测流速的效果类似。
统为水-丙酮和盐系统,这些系统可分别通过测定吸收值和电导迚行监测。根据层析介质的化学属性,推荐以下样
品和洗脱液:
介质 除疏水合成聚合物, RPC 和 HIC 介质以外 的所有介质 RPC 和 HIC
所有介质
洗脱液 水
样品 1 -2% 丙酮水溶液
20%乙醇
1 -2%丙酮,至少 20%
的乙醇
0.4 M NaCl(溶于水) 0.8 M NaCl(溶于水)
术语 塔板数 平均停留时间* 方差*
2
停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 理论塔板数
N μ1
σ
tR VR Wh
L d/P HETP
最佳柱效
对于生物过程色谱中使用的有孔介质,其最佳柱效时实验测定的塔板高度 h 小于等于 3。就峰的对称性而
言,理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度 h ≤ 3 时,一般能接受的范围通常在 0.8-1.8 之间。需要谨记
Sepharose Fast Flow,
Sepharose XL, Capto™, MabSelect™
N/m ~20000 ~11000 〉10000 〉10000 ~9000 ~3000
As 0.8~1.5 0.8~1.5 0.8~1.8 0.7~1.3 0.8~1.5 0.8~1.5
氨基甲酸酯柱后衍生检测方案书介绍
氨基甲酸酯TW-PCD2000柱后衍生设备检测方案书介绍农残检测方法主要有液相色谱法、光谱法、气质联用等,其中柱后衍生的高效液相法方法简单、可靠、灵敏度高。
泰特仪器衍生系统引进国外先进的温度控制技术和关键的控制元器件,各项性能均能达到国外同类型仪器的指标,完全可以满足农业部相关标准的要求。
且性能价格比远优于进口产品。
柱后衍生原理背景氨基甲酸酯类农药由于高效、经济而被广泛应用于蔬菜水果种植过程,但会对生态环境造成严重污染,并引发中毒。
2004 年发布的我国农业标准NY/T 761 中,柱分离后在线水解生成的甲胺进行荧光衍生的检测方法作为蔬菜和水果中氨基甲酸酯类农药多残留检测方法被采纳。
N-氨基甲酸酯类化合物经反相色谱法分离,柱后在碱的条件下水分解生成甲胺。
生成的甲胺与一级胺的荧光衍生化试剂O-苯二甲醛(OPA)反应,进行较高灵敏度的荧光检测。
氨基甲酸酯的一般结构是N-甲基取代氨基甲酸酯,有不同的成酯基团。
结构分子式如图图中的10 种氨基甲酸酯的分离可用5μm C18 柱温恒定、以水/甲醇梯度洗脱。
其出峰顺序根据其相对的疏水性。
氨基甲酸酯(methiocarb)疏水性最强,最后被洗脱出来。
分析过程:氨基甲酸酯首先被NaOH溶液在100℃水解形成醇、碳酸盐、和甲胺。
第二次反应中甲胺与邻苯二甲醛(OPA)和亲和试剂Thiofluor TM试剂反应形成一种高荧光的衍生物。
注意:1-萘酚不需要衍生也有荧光,胺甲萘水解后衍生也生成1-萘酚,但是两者具有不同的保留时间。
这一特点可被用于故障诊断。
基本样品制备下面是对蔬菜和水样品的制备。
更多的细节请参看EPA531.2 对饮用水的检测,AOAC 对蔬菜的检测。
对蔬菜样品的检测用已睛提取氨基甲酸酯,用甲醇重新溶解,用0.45μm 滤膜过滤对水样品的检测采样标准EPA 采用标准1 加1.8mL ClorAC 缓冲液到60mL 样品瓶(井水和河水见注释)2 如果样品被氯化,每60ml 样品加入5mg 硫代硫酸钠。
实 验 须 知 天津科技大学
PART C 酶工程实验实验十六 层析柱装填及柱效测定一、实验目的和内容目的:1. 掌握凝胶过滤层析的原理,掌握凝胶柱柱效测定方法;2. 熟悉凝胶层析的一般过程;3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容:1. Sephadex G-50凝胶柱的装填;2. 凝胶柱柱效测定;3.凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱(1×40 cm),砝码天平,玻璃棒, 分部收集器,核酸蛋白质检测仪,记录仪,滴头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50,0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液,5%丙酮(PBS缓冲液作为溶剂)三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度,计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积,计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶,加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气,并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液(重复使用的填料,从此步开始)边搅拌,边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中,使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5~1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子,吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上,应避免将床面凝胶冲起 (参考完成时间11:30)打开下口夹子,使样品溶液流入柱内,同时收集流出液,当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子按加样操作,用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3-4 mL洗脱液于凝胶上,旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵,柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连,比色池出液口再与自动部分收集器相连,用两根导线将检测仪与记录仪连接起来,设置好基线的位置洗脱时,打开上、下进出口夹子,用0.02mol/L pH8.0的PBS,以0.5~1 mL/min流速洗脱,记录t(记录仪纸速设为12cm/h,电压200mv;核酸蛋白监测r仪检测波长254nm,灵敏度为0.1A), 计算单位高度的柱效 (参考完成时间16:00)柱效计算公式:N = 5.54•[θr /( W1/2)]2其中,θr为平均洗脱时间,W1/2为半峰宽。
高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱柱柱效测定一、实验目的1.了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2.学习高效液相色谱仪的使用3.学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法,它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱,即:222/11654.5⎪⎭⎫ ⎝⎛=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=Y t Y t n R R 式中:t R 为组分的保留时间Y 1/2为色谱峰的半峰宽度Y 为色谱峰的峰底宽度三、仪器和试剂1.仪器1:高效液相色谱仪(紫外检测器)2.仪器2:高效液相色谱仪(紫外检测器)3.50μl 微量进样器4.试剂:苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯;纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μl/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件1.色谱柱1长15cm ,内径 4.6mm ,装填10μm 的C-18烷基键合固定相2.色谱柱2长15cm ,内径 4.6mm ,装填5μm 的C-18烷基键合固定相3.流动相 甲醇:水(85:15),流量0.8ml/min4.紫外光度检测器 波长254nm ,灵敏度0.085.进样量 5μl五、实验步骤1.根据实验条件和实验录像指导,按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态,待仪器流路及电路系统达到平衡,色谱工作站之“采样系统”基线平直时,即可进样。
2.吸取5μl 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样,并用色谱工作站记录色谱数据,同时记录色谱数据文件名。
3.用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
4. 在仪器上测定色谱柱2的塔板数,打印色谱图并比较色谱柱柱效差异。
六、数据记录及处理1.记录实验条件。
(1)色谱柱与固定相(2)流动相及其流量、柱前压(3)检测器及其灵敏度(4)进样量2.记录色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。
DB—1MS气相色谱柱法测定面包和糕点中的甜蜜素
DB—1MS气相色谱柱法测定面包和糕点中的甜蜜素摘要:建立一种运用DB-1MS毛细管色谱柱测定面包和糕点中甜蜜素的分析方法。
甜蜜素和NaNO2在H2SO4酸性条件下生成环己基亚硝酸酯,运用DB-1MS毛细管色谱柱进行测定。
在1.0~50μg/mL线性范围内,衍生化后标准曲线的重现性较好,相关系数为0.9999。
当添加浓度为0.06g/kg时,方法回收率为88.5%~108.3%;分流比为5∶1时,方法检出限为10.8mg/kg。
本法灵敏度高,方便快速,具有良好的回收率和方法检出限,适用于面包、糕点中甜蜜素的检测分析。
关键词:DB-1MS毛细管色谱柱;甜蜜素;重现性甜蜜素(环己基氨基磺酸钠)是一种人工合成的非营养型食品甜味剂,广泛应用于蜜饯、酿造等各种食品。
我国对食品中甜蜜素有严格的限量标准,面包和糕点中的限量均为0.65g/kg(以环己基氨基磺酸计)[1],美国、加拿大、欧盟和日本等国家则禁止使用甜蜜素作为食品添加剂[2]。
GB/T5009.97-2003推荐糕点中甜蜜素测定采用薄层层析法进行分析。
事实上,由于薄层色谱法的繁琐、费时以及试剂有毒等因素,正逐渐被气相色谱法所取代。
目前已有不少文献相继报道了对上述国标方法的探讨和改进[3-6]。
除改进前处理方法外,气相色谱条件的优化也是研究热门之一。
在GB/T5009.97-2003中,气相色谱法推荐使用的2mU型不锈钢柱,也正逐渐被高灵敏度和低流失的毛细管色谱柱代替[7,8]。
但是目前较多使用的毛细管色谱柱为弱极性,如HP-5[8,9]、DB-1701[4],中等极性,如DB-35[10]和极性DB-FFAP[11]等色谱柱,另有报道使用DB-1色谱柱对葡萄酒中的甜蜜素进行测定[12]。
本试验采用DB-1MS非极性毛细管色谱柱对面包和糕点中甜蜜素的含量进行了分析,以期为准确定量分析甜味剂提供有效的检测方法。
1材料与方法1.1仪器与试剂气相色谱仪Agilent7890A,FID检测器,离心机。
美国药典色谱柱型号对照之欧阳体创编
美国药典色谱柱型号对照下面是USP规定的编号所对应的色谱柱类型。
L1:十八烷基键合多孔硅胶或无机氧化物微粒固定相,简称ODS柱L2:30~50mm表面多孔薄壳型键合十八烷基固定相,简称C18柱L3:多孔硅胶微粒,即一般的硅胶柱L4:30~50mm表面多孔薄壳型硅胶柱L5:30~50mm表面多孔薄壳型氧化铝柱L6:30~50mm实心微球表面包覆磺化碳氟聚合物,强阳离子交换柱L7:全多孔硅胶微粒键合C8官能团固定相,简称C8柱L8:全多孔硅胶微粒键合非交联NH2固定相,简称NH2柱L9:强酸性阳离子交换基团键合全多孔不规则形硅胶固定相,即SCX柱L10:多孔硅胶微球键合氰基固定相(CN),简称CN柱L11:键合苯基多孔硅胶微球固定相,简称苯基柱L12:无孔微球键合季胺功能团的强阴离子交换柱L13:三乙基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相(C1),简称C1柱L14:10mm硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相,简称SAX柱L15:已基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相,简称C6柱L16:二甲基硅烷化学键合全多孔硅胶微粒固定相 C2柱L17:氢型磺化交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,强阳离子交换柱L18:3~10mm全多孔硅胶化学键合胺基(NH2)和氰基(CN)柱L19:钙型磺化交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,强阳离子交换柱L20:二羟基丙烷基化学键合多孔硅胶微球固定相(Diol),简称二醇基柱L21:刚性苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球填料柱L22:带有磺酸基团的多孔苯乙烯阳离子交换柱L23:带有季胺基团的聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯酸酯多孔离子交换柱L24:表面含有大量羟基的半刚性聚乙烯醇亲水凝胶柱L25:聚甲基丙烯酸酯树脂交联羟基醚(表面含有残余羧基功能团)树脂。
能分离分子量100~5000MW范围的水溶性中性、阳离子型及阴离子型聚合物(用聚氧乙烯测定)的固定相L26:丁基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相,即C4柱L27:30~50mm的全多孔硅胶微粒L28:多功能载体,100Å的高纯硅胶加以氨基键合以及C8反相键合的官能团L29:氧化铝,反相键合,含碳量低,氧化铝基聚丁二稀小球,5mm,孔径80ÅL30:全多孔硅胶键合乙基硅烷固定相L31:季胺基改性孔径2000Å的交联苯乙烯和二乙烯基苯(55%)强阴离子交换树脂L32: L-脯氨酸铜配合物共价键合于不规则形硅胶微粒的配位体的交换手性色谱填料L33:能够分离分子量4000~40000MW范围蛋白质分子的球形硅胶固定相, pH稳定性好L34:铅型磺化交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物强阳离子交换树脂,9mm球形L35:锆稳定的硅胶微球键合二醇基亲水分子单层固定相,孔径150ÅL36:5mm胺丙基硅胶键合L-苯基氨基乙酸-3,5二硝基苯甲酰L37:适合分离分子量2000~40000MW的聚甲基丙烯酸酯凝胶L38:水溶性甲基丙烯酸酯基质SEC色谱柱L39:亲水全多孔聚羟基甲基丙烯酸酯色谱柱L40:Tris 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯纤维素涂覆多孔硅胶微球L41:球形硅胶表面固定α1酸糖蛋白固定相L42: C8和C18硅烷化学键合多孔硅胶固定相L43:硅胶微球键合五氟代苯基固定相L44:多功能固定相,60 Å高纯硅胶基质键合磺酸阳离子交换功能团和C8反相功能团L45: β-环糊精键合多孔硅胶微球L46:季胺基改性苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球L1 Octadecyl silane chemically bonded to porous silica or ceramic. L1 十八烷基键合硅烷化学键合于多孔硅胶或陶瓷微粒,3-10u。
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检测系统的滞留体积
外体积(Vext)应尽量保持足够的低。这一体积指 的是上游体积(从上样点到柱体之间)和下游体积 (从柱底到检测器)之和。与扩大样品体积的效果 类似,不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱 效柱效 (图 4) 。 因此用于检测的管路应尽可能的短, 并且内径应最小且不会造成过大压降。
不对称性
简化塔板高度
对称性
不对称导电峰 不对称性 UV 峰 流速(cm/h) 流动相电导(Ms/cm)
不对称性 简化塔板高度
图 2.在装填 Sepharose™ XL 评价柱效时流动相电导 对对称性的影响。该柱床的检测样品含 1%的丙酮 和 1 M 的 NaCl(样品体积为 1%柱体积) 。当洗脱 液的电导发生改变时样品浓度保持不变。所有操作 中紫外测定的对称性在 1.2 -1.4 之间。流动相电导 值对电导对称性的测定具有极强的影响。若使用的 洗脱液电导过弱,则会出现一个前倾峰。
*从示踪信号整合中衍生出的停留时间分布(RTD)曲线上 的第一和第二参量。 **达到最大峰高的时间(或洗脱体积)所对应的停留时间 (停留体积) 。
图 1.脉冲检测计算和术语的示意图概况。
通过测定峰宽和对称性简化峰的评价 峰的展宽通常通过塔板数 N 或理论塔板塔 板高度(HETP)进行描述。该概念和多槽 串联模型等价, 反应了平衡阶段层析柱所体 现的塔板数量。 常用的用于评价脉冲检测(确定塔板数量) 的方法包括测定最大峰高一半时的峰宽。 该 方法是数值曲线整合方法的替代。 数值曲线 方法中需要应用参量, 其中第一个参量为平 均保留体积/时间,第二参量为保留体积/时 间的方差。如图 1 所示,将脉冲反应和时间 或洗脱体积进行作图, 同时测定半峰高时的 峰宽,并将其与洗脱时间相关联,或者更适 宜的方式是测定最大峰高处的洗脱体积。 在 最大峰高处测定得到的保留时间和保留体 积与平均停留时间或对称峰(高斯峰)形状 的体积相对应。 折合塔板高度 h 是一个使用方便, 用于定性 描述性能的无量纲参数。 该参数与层析柱长 度和介质的颗粒半径无关, 可以方便地比较 各个层析柱的性能。 测定峰上升和下降 10%处的峰高是简化评 价柱效的一个标准。 柱床装填本身的不均匀 以及管道和柱床外组件内液流不畅都会造 成理想峰对称性(As=1)的偏差。此外,柱 床内进气泡或填料堵塞或者液体流动不均 匀,都可能影响峰的对称性。 最佳柱效 对于生物过程色谱中使用的有孔介质, 其最 佳柱效时实验测定的折合塔板高度 h 小于等 于 3。最佳柱效需要在最佳检测条件下,用 填充良好的柱床以及优化设置好的层析柱 和层析系统进行测定才能获得。实际操作 中,会对可接受的标准进行适当的调整(如 硬件很难得到) 。在过程中采用高流速,在 高通量生产系统下进行操作对于在最佳条 件下进行柱效测试可能并不适合。 根据特定的应用, 最佳柱效测定中适当的偏 差是可以接受的。 为了对包括高分辨的凝胶 过滤和挑战性的精细纯化在内的所有色谱 应用都能有效进行验证, GE Healthcare 提供 了一些推荐方案,旨在获得高效参数。 对称性 就峰的对称性而言,理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度h ≤ 3时,一般 能接受的范围通常在0.8-1.8之间。需要谨记 的是以柱宽而言, 柱效越低通常意味着峰对 称性越好。
图 3. 填充床采用不同流速检测时的折合塔板高度 和对称性。当使用最佳检测流速(20 cm/h)时,折 合塔板高度为 2.3,而流速在 80 cm/h 时,高度增加 100%。 表 1.对所选介质适合的检测速度 颗 粒 大 小 (μm) 15 30 35 介质实例 SOURCE™ 15 SOURCE 30 Sepharose High Performance, Superdex™ Sephacryl™ Sepharose Fast Flow, Capto™, MabSelect™ Sepharose Big Beads 速度(cm/h) 60 60 30
平均停留时间* 方差* 停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 一个理论塔板的等价高度 折合的塔板高度
脉冲检测
脉冲功能是检测使用的最为常见的信号类 型。 将小体积的示踪物质加入靠近层析柱入 口的液流时, 这一展宽的脉冲信号在层析柱 出口处分析图 1 中给予了总 结。 柱效通常被认为包括两个参数: 整个层析柱的峰展宽情况通常用等价 数量的理论塔板数进行描述(平衡阶 段) 峰对称性通常用峰对称性 As 进行描述。
As=b/a
示踪物质浓度 术语 塔板数
半峰高峰宽 Wh
时间(洗脱体积 V) 停留时间(停留体积) 相对峰宽通常用一定数量的理论塔板(N) , 一个理论塔板的等价高度(HETP) 或更常用折合了的塔板高度(h)来进行描述: 对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏差,通过对 10% 峰高处的峰宽进行计算得到:
柱效检测是示踪物质流经柱床时的保留时 间的分析。 加载于柱子上的典型检测信号通 常是脉冲或阶跃信号。 为了在不干扰的情况 下对层析柱进行分析, 必需对示踪物质和洗 脱条件进行选择, 以避免化学物质与介质发 生相互作用以及干扰液体流动。
N μ1 σ2 tR VR Wh L d/P HETP h=HETP/d/P 对称性 As
液体流速
峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效柱效在很大 程度上取决于检测过程中所使用的液体流速。理论 上,峰展宽和液体流速之间的关系可通过范德姆特 方程进行描述(1) : HETP=A+
B +C×u u
50 75-100
20 20
其中 A 指的是湍流扩散 B 指的是分子扩散 C 指的是传质阻力 u 指的是液体流速(cm/h) 图 3 示实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影 响。当液体流速在 20 cm/h 左右时折合塔板高度最 小且柱性能最大。当速度降低时,由于范德姆特方 程中 B 对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。 在 高检测速度时,由于在层析柱中保留时间缩短,根 据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制, 导 致峰宽增加。值得一提的是图 3 中的峰的对称性随 液体速度的提高而减小,这主要还是由于建立的检 测方法减小峰的展宽从而影响到对称性(如上所 述) 。 允许标准 h≤ 3 保证了合适液流速度, 从而可以得到 最佳的理论柱效柱效。 颗粒大小 (扩散的特征长度) 是决定最佳流速的主要参数(见表 1) 。
总结
最佳柱效柱效质量认证参数规定如下: 折合塔板高度 h≤3 对称性 0.8 < As < 1.8 这些指标依赖于检测条件和参数优化使用 包括: 不与介质发生相互作用的一种惰性示 踪物质 能发挥最大理论柱效的最佳液体流速 低外体积 脉冲检测的样品体积小(1%柱体积) 实验步骤参考 系统准备 · 首先需要对系统和管道进行润洗准备 · 其次需清除在包装、储存或运输过程中累 积在管道和分流系统中的空气 · 再者,需将层析柱置于 1.5 柱体积以上的 洗脱液中进行平衡。 若柱平衡在盐溶液中 进行, 则需要保证出口的电导和入口的电 导一致。 平衡时的液流方向需与测试时一 致。测试方向既可向上流也可向下流。 运行脉冲柱效检测 将提前准备好的一定体积的样品(1%柱 体积) 加载于柱上, 上样最好采用样品环, 超级容量杯或样品泵。 如果没有这些设备 对样品进行分散处理, 可以在第一步就将 样品加载入系统, 并采用层析柱的旁路模 式进行操作。 在预期的样品体积加载在层 析柱以后,将层析柱切换至旁路模式,使 样品专为洗脱成分, 这些都在最终的实际 脉冲检测之前进行。 无样品环或样品泵条件下逐步进行柱效 检测 1. 将洗脱成分置于系统的一个入口上, 同时 样品放在另一入口。 如果系统具有梯度功 能, 则可选择将样品放置在另一入口, 泵 A 或泵 B。
GE Healthcare 应用手册 28-9372-07 AA 层析柱
柱效检测
固定柱床层析是一种多功能的分离技术, 常 用于生物医药的分离中。 无论是在保证纯化 过程的稳定性还是保证最终产物的安全性 上, 填充柱的制备和质量认证都是极为重要 的步骤。 柱效检测在认证和监测装填柱子效 果方面具有重要的地位。 即使柱效检测不能 作为单一参数对后期的纯度和回收率进行 预测, 至少在启动纯化工艺前可作为一种快 速途径对层析柱和设备性能进行检测。 该项 检测还可用于检查不同运作批次之间柱床 完整性的改变。 该手册对检测原理进行一个 简要的剖析, 并对柱效检测的实验检测操作 进行简要的描述。 为方便开发出稳定的检测 方案,给予了适当的检测条件,并对其中对 检测性能有重要影响的参数进行讨论。 理论背景
200
10
样品体积
通过脉冲实验所进行的柱效柱效测试通常使用的 样品体积为 1%的柱体积(Vc) 。当某些硬件条件无 法满足时,可以在经验范围内进行微小优化以加强 对示踪物质的检测能力。然而,值得一提的是,对 于柱效好的柱子来说增加脉冲实验中样品体积可 能导致色谱峰明显加宽,降低塔板数。这一点对于 小颗粒直径的层析介质而言尤为常见(1) 。由于峰 宽增大,峰对称性可能有所改善。这一点与增加检 测流速的效果类似(见图 3) 。
UNICORN™评价软件的微分函数功能进行 F(t)函 数的计算。以下例子中,阶梯函数通过脉冲函数 E(t)作图。第二步中,计算得到的脉冲函数如图 1 所示进行分析。 实验数据:阶梯函数
计算数据:脉冲函数
图 5. 在转换分析中得到的阶梯函数对柱效 柱效进行评价。 当某些硬件使用受到限制时可通过转换分 析对层析柱进行质量认证。此外,转换分析 还可作为工艺过程中柱效柱效在线监测的 工具(比如后续的步骤电导变化时) 。然而, 为了获得稳定的柱效(如上所述)需要对某 些参数和前提条件进行设定, 如示踪物质的 惰性,流体密度和粘度的稳定性,尤其是体 流速等。最后,通过在线监测获得的柱效数 据和在初始层析柱质量认证过程中通过脉 冲方法获得数据有明显的区别。
然而这样会使得装柱过程的各种缺陷进行 观察和纠正的难度有所增加, 并且会导致层 析柱和层析系统构建不当增多。 适宜检测条件的选择 理论上来说, 生物过程应用中使用有孔层析 介质时,当塔板高度通常在 h=1.5 到 2 之间 时往往能获得最佳柱效。 这套理论柱效是通 过范德姆特分析衍生而出, 反应出最佳检测 环境下(即液体流速)填充床内的对流和扩 散分散效应。 其余的峰扩散来源主要包括了 柱床装填不均一,层析柱液流分布不均匀, 系统效应以及样品体积等因素。 为了给层析 柱设定适宜的参数(也为了解决问题) ,需 要对这些导致峰展宽的原因进行严加控制, 这样才能定义影响理论塔板数柱效的基准。 示踪物质 示踪物质的选择需要保证物质大小(分子 量)能完全渗透进入层析介质的孔隙结构 内。 必须避免示踪物质与层析介质发生表面 相互作用, 以保证示踪物质是化学惰性和稳 定的。此外,洗脱成分和样品的粘度和密度 差异应降低至最小, 以避免由不稳定流动模 式(粘度指纹效应)造成的系统误差。 通常使用的,能符合这些要求的样品/ 洗脱 系统为水-丙酮和盐系统,这些系统可分别 通过测定吸收值和电导进行监测。 根据层析 介质的化学属性,推荐以下样品和洗脱液: 对于除疏水合成聚合物,RPC 和 HIC 介质 以外的所有介质: 洗脱液:水 样品:1 -2% 丙酮水溶液 对 RPC 和 HIC 而言: 洗脱:20%乙醇 样品:1 -2%丙酮,至少 20%的乙醇 对于所有介质: 洗脱:0.4 M NaCl(溶于水) 样品:0.8 M NaCl(溶于水) 当使用 NaCl 作为示踪剂时,洗脱液中至少 要用 0.4 M NaCl(35 – 40 mS/cm)对示踪剂 和层析介质之间的电荷相互作用进行有效 地抑制 (否则可能会导致不恰当的检测结果 发生) 。当时用的示踪物质与介质发生相互 作用时,峰对称性受到破坏,这一例子见图 2