医学检验实验课

• • • • • • • • • • 微孔反应板（48人份） 酶结合物（6.2 mL *1瓶） 阳性对照（1.0 mL *1瓶） 阴性对照（1.0 mL *1瓶） 洗涤液（40 mL *1瓶） 显色剂A（8.0 mL *1瓶） 显色剂B（8.0 mL *1瓶） 终止液（7.0 mL *1瓶） 封片（2张） 说明书（1份）
实验原理：
• 酶联免疫检测（ELISA）
– ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。 – 它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的 一种免疫酶技术。 – 此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速， 目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
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实验第三步：
• 每孔先加入显色剂A液1滴（50微 升），再加入B液1滴（50微升）， 充分混匀 • 封板，置37℃水浴箱孵育15分钟。
实验第四步：
• 每孔加入终止液1滴（50微升），混 匀。 终止液为强酸溶液，使酶蛋白变性， 终止酶促反应，故加样时应注意。 目视读数。
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目视读数：
– TMB在酶的作用下呈蓝色， – 加入终止液（稀硫酸）后变黄，
• 每盒试验需设阳性对照2孔，阴性对 照2孔， 空白对照1孔 • 每孔中加入待测标本50微升 • 除空白孔外每孔加入酶结合物50微升 • 封板 • 置37 ℃恒温孵育30分钟
实验第二步：
• • 洗板 手工洗板：首先弃去孔内液体，分别 各孔注满洗涤液，静置2分钟，甩干， 重复5次后拍干。 每次洗板要甩干微孔里的残液，避免 残余游离酶标记物显色干扰读数。
• ELISA是以免疫学反应为基础，
• 抗原、抗体的反应在固相载体──聚苯乙烯微量滴定板
的孔中进行， • 微孔对蛋白有很好的吸附作用，（试剂盒已经包埋好 相应的抗原、抗体蛋白成分） • 每加入一种试剂孵育反应后，多余的游离反应物可洗 涤除去，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
反应过程：
• 包被：将已知抗体或抗原通过物理吸附结合到固相 载体表面使其固相化
器 材：
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实验准备：
• • • 取出试剂盒，室温平衡30分钟 配制洗涤液（1：25倍稀释） 样本血清制备：用真空采血管 抽取空腹静脉血5mL，静置15分 钟后，以3500转/分, 离心5分钟, 分离血清备用。
实验第一步：
• ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学 反应的基础上，因而，具有特异性。 • 而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分 子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化 底物分子发生反应，产生放大作用，使本法
具有很高的敏感性。
反应类型
酶标记抗体
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夹心法 抗体 间接法 包被抗原 竞争法 捕获法 应用生物素-亲和素系统的ELISA
仪器读数：
酶标仪参数：
• OD值：样本的吸光度 • Cutoff值：厂家设定的此批试剂盒 判定阳性结果的最低OD值 • COV：计算出的Cutoff值 • S/CO：样本吸光度/COV
• Cutoff值计算： COV=阴性对照平均OD值×2.1 • 标本OD值≥COV为阳性； • 标本OD值＜COV为阴性； • 阴性对照OD值低于0.05作0.05计算， 高于0.05按实际OD值计算
• ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已
成功地应用于多种病原微生物所引起的传染
病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量
测定，根据已经使用的结果，ELISA法具有
灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动
化操作等特点。
实验材料：
• 乙型肝炎病毒检测试剂盒
试剂盒:
临床免疫学检查
中国医科大学一院检验科
实验内容：
• 乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物检查
• • • • • HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAb -乙型肝炎病毒表面抗体 HBeAg -乙型肝炎病毒e抗原 HBeAb -乙型肝炎病毒e抗体 HBcAb -乙型肝炎病毒核心抗体
实验要求：
• 掌握酶联免疫的检测原理 • 了解试剂盒的使用 • 掌握乙型肝炎病毒标志物 检测结果的临床意义
一)双抗体夹心法
1.将已知抗体包被微量反应板，和待检 抗原反应，再加酶标抗体和底物，根 据显色反应对抗原进行定性或定量。 2.是检测抗原最常用的方法。
二）间接法
• 标本中的待检抗体与固相抗原结合后， 利用酶标记抗抗体（抗人Ig）进行检测。 • 是检测抗体的最常用方法
三）竞争法
• 将待检抗原和酶标抗原与相应固相抗 体竞争结合，标本中抗原越多，与固 相抗体结合的酶标抗原越少，与底物 反应生成的颜色越浅，根据颜色深浅 可定性或定量测定。 • 可用于测抗原，也可用于测抗体
• 抗原抗体反应：加入被检标本和酶标记物，使之与
固相抗体或抗原发生免疫反应而被结合固定，经洗 涤除去游离的酶标记物 • 酶促反应：加入酶底物，使之发生酶促反应而显色。
ELISA反应材料：
• 固相载体：聚苯乙烯或聚氯乙烯 有较强的蛋白吸附性能 • 酶标记物：标记抗原或抗体的酶常选择 辣根过氧化物酶（HRP） • 酶底物： 四甲基联苯胺（TMB） 受酶作用后呈蓝色
• 反应孔颜色深浅同阳性对照孔颜色 比较 • 颜色相同或接近判定为阳性， • 颜色相差区别大判定为阴性。
显色系统：
• 在450nm波长有最高吸收峰， • 通过颜色变化及呈色深浅来推断检测 对象的有（无）或含量（定量）。
接收器 透光板
光源
仪器读数：
• 酶标仪读数：先用空白孔校零， 再用波长450nm（建议使用双波长 的酶标仪比色，参考波长630nm） 读取各孔OD值。
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常 见 模 式
HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb 抗HBc
临床意义
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急性HBV感染“窗口期” 或既往曾感染过乙肝， 有流行病学意义
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疫苗接种后或HBV感染 后康复
急性乙肝康复期，开始 产生免疫力 乙肝恢复期，弱传染性
男，近一月乏力、腹胀，最近一 周皮肤及眼睛发黄。 • 体检；消瘦，面部及上胸部可见蜘蛛痣， 皮肤巩膜黄染。 • 临床化学检查： TP50g/L,ALB20g/L,ALT243g/L • 免疫检查：HBsAg+,HBsAb,HBeAg+,HBeAb-,HBcAb+,AFP+ • 初步诊断？依据？
HBV标志物联合检测的临床意义：
常 见 模 式
HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb 抗HBc
临床意义 急性或慢性乙型肝炎， 高传染性 急性、慢性乙型肝炎或 慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢 性乙肝，弱传染性 急性HBV感染康复期或 有既往感染史
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