体外核酸诊断试剂盒引物探针研发的基本流程概要共25页

体外诊断试剂生产及质量控制—PCR诊断类报批稿

核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而检测特定核酸序列或筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。

本指导原则仅适用于核酸扩增法检测试剂的生产及质量控制，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。国家药品监督管理部门依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本要求

（一）核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

（二）试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。

（三）试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（四）核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。

（五）企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。

第六章探针制备与标记技术

实验一核酸探针的制备

一、原理和用途

核酸探针制备的方法很多，经典的方法包括以重组单链噬菌体为模板的单链DNA 探针的合成，利用体外转录原理进行的单链RNA探针的合成，以mRNA为模板进行的cDNA探针的合成，以及寡核苷酸的人工合成；目前更为常用且简便的是双链DNA探针的制备，其来源包括纯化的限制性酶切片段或PCR产物。本实验以M13噬菌体为模板，学习单链DNA探针合成的基本操作。

单链DNA探针合成的基本原理是将人工合成的寡核苷酸与重组M13噬菌体中的单链DNA退火结合，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（简称Klenow酶）对退火引物的延伸作用，催化与模板链互补的标记探针的合成。由于反应产物长度及放射性标记dNTP结合量的均一性不高，通常需要对反应产物进行限制酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，以便获得长度一致的双链DNA探针。

单链DNA探针特别适合用S1核酸酶或绿豆核酸酶进行的mRNA 5¹端结构分析，真核基因外显子位置的确定，以液体杂交进行的mRNA定量，无载体序列探针的制备，以及基因或cDNA特定区域的显示等。由于M13噬菌体载体的多克隆部位上游多有lac 基因或T7等启动子序列，根据这些序列合成的寡核苷酸可以作为通用引物，用于任何与噬菌体插入片段互补的单链DNA探针的制备。

二、实验材料

单链M13噬菌体DNA。

三、溶液与缓冲液

1．10 mol/L 醋酸钠

2．1 mol/L DTT

3．0.5 mol/L EDTA，pH 8.0

4．5 mol/L NaCl

5．1：1（V/V）苯酚/氯仿混合液

磁珠pcr试剂盒生产工艺流程

温馨提示：文档内容仅供参考

磁珠PCR试剂盒是一种广泛应用于分子生物学实验的试剂盒，用于DNA扩增和检测。以下是一般的磁珠PCR试剂盒的生产工艺流程：

原材料准备：

采购和准备所需的原材料，包括酶、缓冲液、引物、探针、核酸模板、磁珠等。

酶和缓冲液的制备：

根据配方准确称取酶和缓冲液的原料，进行溶解和混合，制备酶和缓冲液的工作溶液。

引物和探针的制备：

根据设计的引物和探针序列，采购相应的寡核苷酸原料，并进行合成和纯化。

核酸模板的制备：

从细胞或组织中提取目标核酸，经过纯化和浓缩处理，得到高质量的核酸模板。

磁珠的制备：

根据配方准确称取磁珠的原料，进行溶解和混合，制备磁珠悬浮液。

试剂盒组装：

根据产品规格和配方，准备试剂盒的各个组分，包括酶、缓冲液、引物、探针、核酸模板、磁珠等。

质量控制：

对生产的试剂盒进行质量控制检验，包括酶活性检测、核酸模板污染检测、引物和探针的特异性检测等。

包装和标签：

对通过质量控制的试剂盒进行分装和包装，同时进行产品标签的贴附，包括产品名称、批号、有效期等信息。

产品存储和配送：

将包装好的试剂盒存储在适当的条件下，如低温保存，并进行配送到销售渠道或最终用户。

需要注意的是，具体的生产工艺流程可能会因不同厂家和产品而有所差异，上述流程仅为一般参考。在实际生产中，还需要遵循相关的质量管理体系和标准，确保产品的质量和安全性。

PCR技术上岗培训

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PCR定量为何要设内参照？影响PCR定量的主要原因有1、反应效率的差异：可能为反应体系和
PCR扩增仪的工作状态所致。由于PCR产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行PCR扩增，起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。2、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定PCR反应周期后间隔测定PCR终产物的浓度。
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荧光标记
• 荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团
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探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）
• 简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA 扩增液和水浴锅上进行变性退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
• 对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则——生物芯片类试剂生产教程文件

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则——生物芯片类试剂生产及质量控制技术指导原则（报批稿）

本指导原则所定义的生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗体，组织，细胞等）按预先设计的排列方式固定在特制的基质（包括玻璃片，尼龙膜，硝酸纤维素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并进行标记，然后与固定在基质上的生物探针特异性的结合，再用相应的检测设备（如激光扫描仪、CCD检测仪等）和分析方法（包括软件）进行检测、记录、分析，实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂。

根据芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分为核酸芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。本指导原则是针对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的生产及质量控制技术指导原则，其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则。国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）试剂研制、生产用各种原料、辅料等应制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

（二）试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（三）生物芯片类试剂在研制时，应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）试剂研制、生产过程中所用的物料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

MP核酸检测试剂盒说明书

肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）说明书

【产品名称】

通用名称：肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（PCR荧光法）

英文名称：PCR-Fluorescence Detection Kit for Mycoplasma Pneumonia

【包装规格】32人份/盒

【预期用途】本产品用于定性检测痰液或咽拭子中的肺炎支原体核酸。

肺炎支原体（）是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断。若要明确诊断，需要进行病原体的检测。而病原体核酸检测是目前最为直接的检测手段。

适应症：由肺炎支原体感染引起的肺炎等疾病。

【检验原理】

本试剂盒选用肺炎支原体（MP）保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对肺炎支原体核酸的自动化检测。

【主要组成成份】

注: 不同批号试剂盒中各组份不可以互换。

【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月。

【适用仪器】

ABI7300、ABI7500荧光PCR扩增仪。

【样本要求】

1. 标本：痰液及咽拭子。

2. 采集器：应当选用国家批准生产的一次性使用的咽拭子，拭子应当包括洁净海绵头、PP杆、PP杆与海绵头应连接牢固，经无尘清洗包装。

体外诊断试剂生产工艺及质量控制省局

抗原、抗体（包括血型、组织配型）、核酸等－－一般为直接指标；
其它类型蛋白质、多肽、糖类、激素、酶类、酯类、维生素、无机离子等－－一般为辅助指标；
微生物；麻醉、精神、毒性药品。
体外诊断试剂分类（按照学科）
1、临床血液学检验试剂； 2、临床体液学检验试剂； 3、临床化学检验试剂； 4、临床免疫学检验试剂； 5、临床微生物学检验试剂； 6、组织细胞学检验试剂； 7、变态反应、自身免疫诊断检验试剂； 8、遗传性疾病检验试剂； 9、分子生物学检验试剂。
与对照比较
肉眼或仪器检测信号检测结果
校准、质控、标准品（物）的朔源
关键控制点
原材料质量：纯度、生物活性（效价、亲和力、位点等）、多肽核酸序列准确性、含量、浓度（前滞反应、后滞反应）、污染（化学物质污染、微生物污染）
工艺：分离、纯化、配制、包被、点样、封闭、干燥、真空度、标记、灭活、醛化致敏、浸润、切割、包装等等。
概念解读
1、检验的标的物是体液、细胞、组织样本；要检验的物质是蛋白质、核酸、离子等等；目的是检查或测定样本中被检测物质的多少（有或无、多或少），从而对健康状态进行评价。
2、总的原则就是使不可见的物质经过生物（如细菌生长）、化学（如显色反应）、生物化学（如酶催化）、免疫（如免疫复合物）、分子生物（如核酸扩增）等反应转化为可观察（肉眼观察）或测量（光、电、磁等物理信号）。

引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒[发明专利]

专利名称：引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒

专利类型：发明专利

发明人：曹雅倩,李静静,李振红,付光宇

申请号：CN202110006876.7

申请日：20210105

公开号：CN112575123A

公开日：

20210330

专利内容由知识产权出版社提供

摘要：引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于诊断高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的PCR荧光探针检测方法，利用本方法制备的试剂盒采用磁珠法提取宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒核酸，并进行实时荧光聚合酶链反应，对样本中的14种HPV DNA型别进行检测并分型HPV16/18型。同时联合细胞学检查进行女性宫颈癌筛查。本试剂盒可用于患者宫颈细胞样本中高危型人乳头瘤病毒的定性检测，在检测HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的同时分型鉴定HPV16和HPV18型。本试剂盒定性检测患者宫颈细胞中的高危型HPV DNA，确定患者是否需要行阴道镜检查。

申请人：郑州安图生物工程股份有限公司

地址：450016 河南省郑州市经济技术开发区经北一路87号

国籍：CN

代理机构：北京集佳知识产权代理有限公司

代理人：张柳

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DIG试剂盒说明书(CSPD)中文翻译版讲解

只用于生命科学研究，不能用于诊断程序

仅用于体外实验

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ

采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。

货号：11 585 614 910

此试剂盒储存条件：-15℃到-25℃。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应，

可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。

指导手册

2005.12 版

1 前言

1.1 内容表

1 前言

1.1 内容表

1.2 试剂盒成分

2.介绍

2.1 产品简介

3. 操作步骤和所需材料

3.1 在你开始前

3.2 流程图

3.3 地高辛标记DNA

3.4 标记效率的确定

3.5 DNA的转移和固定

3.6 杂交

3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交

4. 附录

4.1 故障排除

4.2 参考文献

4.3 订购信息

1.2 试剂盒的成分

附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。

2.介绍

2.1 产品概况

实验原则

此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten 去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。

图1 DIG-dUTP ，碱性标记

图2 CSPD反应

应用

地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交

总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。

体外诊断试剂生产质量控制要点

精密性：用国家参考品或国家参考品标化的参考品进行检定，CV（%）应不高于15%（n=10）。
阴、阳性对照制备的生产和质量控制要点
生产工序生产要点质量控制点
1
阴性血清的灭活
灭活的时间，温度
2 阴、阳性对照的配
*阴性对照的配制
检测阴性OD值
制
3
阳性血清的灭活
灭活的时间，温度
4
*阳性对照的配制
检测阳性OD值
终止液的配制

质量控制点：溶液配制的准确性：
用婆美计测定溶液的比重应符合要求
洗涤液的配制

质量控制点：溶液配制的准确性
用pH计测定溶液pH值
用电导率仪测定溶液电导率
酶结合物制备生产和质量控制要点
生产工序 1 生产关键点酶稀释液的配制质量控制点 pH的控制通过比较阳性参考品、酶结合物的制备、滴配 2 阴性参考品、精密性以 *酶结合物的滴及最低检出率情况，用配方阵滴定法进行EIA法测定确定酶结合物的浓度
体外诊断试剂生产和质量控制要点
主讲人:顾燕黎
上海科华生物工程股份有限公司
体外诊断试剂产品介绍
一酶联免疫诊断试剂产品乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）二快速诊断试剂产品人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒（胶体金法）三PCR核酸诊断试剂产品乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

PCR原理及检测方法

延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，< 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。
延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。
第20页，共53页。
⑷ 循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板
DNA的浓度。理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累
-70℃长期保存
第31页，共53页。
新型甲型H1N1流感检测
第32页，共53页。
核酸提取
使用试剂：核酸提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini
kit（74104）；
预冷的70%乙醇溶液（无RNase水配制）
（自备）； β-巯基乙醇（自备）
基本步骤：
裂解组织，释放核酸；
除去蛋白杂质；
最后获得核酸产物
～ 50
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
(BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
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1.5 ～ 2.0 mM Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应
第6页，共53页。
PCR 的基本反应步骤
变性

UU核酸检测试剂盒产品使用说明书

解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法）说明书

【产品名称】通用名称：解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

英文名称：Detection Kit for Nucleic Acid of Ureaplasma urealyticum (PCR-fluorescence probing)

【包装规格】 32人份/盒

【预期用途】本试剂盒用于定性检测尿道、生殖道分泌物拭子样本中的解脲脲原体核酸成分，主要用于解脲脲原体感染的临床辅助诊断。根据相关文献研究，解脲支原体有14 株脲原体标准血清型可分为微小脲原体（Ureaplasma parvum，UP）1、3、6、14 和解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，UU）2、4、5、7、8、9、10、11、12、13，其中UP为条件致病菌，致病性与其含量有关，且普通人也有携带少量UP。UU是引起非淋球菌性尿道炎、阴道炎等病症的主要致病菌之一，也是引起输卵管炎、盆腔炎、慢性前列腺炎、流产、产后热等的重要病原菌之一。目前，临床上常用的脲原体检测方法有液体培养和核酸检测，但其并不能鉴别出其病菌是UP还是UU。

【检验原理】本试剂盒选用针对解脲脲原体（UU）特异性基因片段设计特异引物及特异Taqman荧光探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA摸板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5´端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3´端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对解脲脲原体（UU）核酸的自动检测，发出荧光信号的强度与UU-DNA的量呈正相关。

曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒 (PCR 荧光探针法)说明书

曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒

（PCR荧光探针法）说明书

【产品名称】

通用名称：曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）

【包装规格】24人份/盒，48人份/盒

【预期用途】

本试剂盒用于体外定性检测人痰液样本中曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的核酸DNA。

本试剂用于肺部曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌真菌感染的辅助诊断，不能单独作为确诊的依据。

适用人群主要为免疫低下、免疫缺陷人群，其他人群应有肺部真菌感染相关指征。

真菌感染常见于免疫低下或缺陷人群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状表现不具有特异性，易被细菌、病毒等感染掩盖，临床上致病菌包括曲霉菌属、隐球菌、耶氏肺孢子菌等，检测多重真菌可用于辅助临床诊断。

本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状、体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

该产品检测阳性不能确定标本中有活病原菌，检测结果应结合其他临床诊断综合判断。

本产品对于曲霉菌属的检测不能确认具体菌种，如有必要临床应考虑对于曲霉菌属阳性结果进一步确认感染的菌种。

【检验原理】

本试剂盒分别选取曲霉菌属18s rRNA基因、新型隐球菌ITS基因和耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA基因中保守的区域设计特异性引物和探针，在样本DNA核酸纯化之后采用荧光PCR对DNA进行检测。

本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，PCR扩增过程中，探针与模板结合，其5’端报告基团被Taq酶5’→3’外切核酸酶活性切断，使报告基团远离淬灭基团，产生荧光信号。荧光定量PCR仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌荧光标记分别为FAM、VIC、CY5。

核酸检测pda操作流程

核酸检测是一种常见的生物学实验技术，用于检测DNA或RNA

的存在和数量。其中，核酸检测PDA（Photodiode Array）是一种

高效、快速、准确的检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科

学等领域。下面将介绍核酸检测PDA的操作流程。

首先，准备实验材料和仪器。实验材料包括待检测的核酸样品、核酸提取试剂盒、PCR试剂盒等。仪器包括核酸提取仪、PCR仪、PDA检测仪等。

第二步，核酸提取。将待检测的核酸样品加入核酸提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的操作步骤进行核酸提取。核酸提取的目的

是将核酸从细胞或组织中提取出来，以便后续的PCR扩增和PDA检测。

第三步，PCR扩增。将提取得到的核酸样品加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。PCR扩增是通过酶的作用，在体外复制DNA或RNA序列的过程，可以将少量的核酸扩增到足够的数量，以便后续

的PDA检测。

第四步，PDA检测。将PCR扩增产物加入PDA检测仪中，进行

核酸检测。PDA检测仪是一种高灵敏度的光学仪器，可以实时监测

核酸的浓度和质量，提供准确的检测结果。

最后，分析结果。根据PDA检测仪的输出结果，可以判断核酸样品的浓度、纯度和质量，从而得出结论。如果需要进一步分析，可以将检测结果与数据库比对，进行生物信息学分析。

总的来说，核酸检测PDA操作流程包括核酸提取、PCR扩增和PDA检测三个步骤，每个步骤都需要严格按照操作规程进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。核酸检测PDA技术的应用范围广泛，可以为医学诊断、疾病预防、环境监测等领域提供重要的支持和帮助。

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明

2
【参考文献】 1. 2. 戴志澄, 祁国明. 中国病毒性肝炎:血清流行病学调查(上卷). 北京:北京科学技术文献出版社, 1997. 60-71. Holland PM, Abramson RD, Watson R and Gelfand DH. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' to 3' Exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1991, 88: 7276–7280. 3. 4. WHO实验室生物安全手册3.0 临床基因扩增检验实验室工作规范
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）操作说明
【产品名称】通用名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 英文名称：Diagnostic Kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA (PCR-Fluorescence Probing) 【包装规格】 32 人份/盒【预期用途】乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原体，具有较强传染性，传播途径复杂，流行面广，发病率高等特点，可导致急慢性乙型肝炎，淤胆型肝炎，严重的可导致急性肝衰竭，临床上主要表现为肝功能损害，部分患者可有黄疸。隐形感染较为常见。目前临床上常用的 HBV 检测方法主要有酶免疫法、化学发光法检测 HBV 标志物和核酸检测 HBV DNA 方法。本试剂盒定量检测人血清和血浆样本中的乙型肝炎病毒 DNA，主要是通过对乙肝患者血中 HBV DNA 基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。检测结果仅供临床参考，不能作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，亦不能作为血液筛查 HBV 病毒的筛查试剂使用。【检验原理】本品基于 TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧光检测乙型肝炎病毒， JOE/RED 610 nm 波长通道检测内参。本品使用外源性内参，可以监控和避免由于样本中的 PCR 抑制物或操作不当引起的“假阴性”结果。【主要组成成份】每个反应组份名称装量主要成份中的用量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 核酸提取液 A 核酸提取液 B 内参 MgCl2 PCR缓冲液A Taq酶 HBV引物探针阴性对照阳性血清对照 3×1.1ml/管 2×1ml/管 160μl/管 450μl/管 480μl/管 160μl/管 320μl/管 100μl/管 100μl/管 100μl 50μl 3μl 13μl 15μl 5μl 10μl －－－ 7 μl 7 μl 7 μl 7 μl 7 μl 聚乙二醇、 NaCl NaOH、SDS、Tween-20、 Chelex-100 合成病毒 MgCl2 Buffer、dNTPs Taq酶、UNG酶 HBV 引物和探针，内参引物和探针 HBV 阴性血清 HBV 阳性血清 HBV 阳性血清寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段【储存条件及有效期】-20℃保存12个月。探针若单独储存，应注意避光。【适用仪器】本品适用于 AB 7300/7500/Mx3000P/LightCycler 480/SLAN 实时荧光定量 PCR 仪。【样本要求】用一次性的针筒抽取病人静脉血 1ml，置于灭菌的一次性试管中室温自然凝固或 800～1600g 离心 20 分钟，取分离出的血清 0.2ml 左右送检。血清标本 2～8℃可放置 72 小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。【检验方法】 1. 试剂配制按样本数（样本数＝待检血清样本数＋血清对照品 3 个＋定量校准品 5 个）n 配制反应液：取 PCR 缓冲液 A n×15μl、HBV 引物探针 n×10μl、Taq 酶 n×5μl、MgCl2 n×13μl 至于一离心管中混匀；低速离

DIG试剂盒说明书(CSPD)中文翻译版讲解

只用于生命科学研究，不能用于诊断程序

仅用于体外实验

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ

采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。

货号：11 585 614 910

此试剂盒储存条件：-15℃到-25℃。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应，

可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。

指导手册

2005.12 版

1 前言

1.1 内容表

1 前言

1.1 内容表

1.2 试剂盒成分

2.介绍

2.1 产品简介

3. 操作步骤和所需材料

3.1 在你开始前

3.2 流程图

3.3 地高辛标记DNA

3.4 标记效率的确定

3.5 DNA的转移和固定

3.6 杂交

3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交

4. 附录

4.1 故障排除

4.2 参考文献

4.3 订购信息

1.2 试剂盒的成分

附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。

2.介绍

2.1 产品概况

实验原则

此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten 去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。

图1 DIG-dUTP ，碱性标记

图2 CSPD反应

应用

地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交

总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。