灭菌及无菌空气的制备
第四章 发酵培养基的灭菌与无菌空气的制备
五、过滤除菌法
是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌
等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养 时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或 培养液。发酵工业常用过滤除菌方法处理热敏性物料 和制备无菌空气。
目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤
是安装滤膜及无菌过滤过程。
c、连续加压灭菌法
在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发
酵工厂中作培养基灭菌用。
主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、
维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～ 140℃下处理5～15秒钟。
二、高温对培养基成分的有害影响及其防止
1、高温对培养基成分的有害影响
2、消除高温有害影响的措施
菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀
死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
（2）实罐灭菌
将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温
度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种 发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。
操作要点：
三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐
内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时 间。这就是所谓的“三路进气”。
细菌名称 枯草芽胞杆菌 硬脂嗜热芽胞杆菌FS1518 硬脂嗜热芽胞杆菌FS617 产气梭状芽胞杆菌PA3679 K值/min-1 3.8-2.6 0.77 2.9 1.8
无菌空气的制备
转换成电讯号。
• 当测量微粒浓度太大时，会因粒子重迭而产生误差，这时 需要用无菌空气将含菌空气中微生物浓度稀释。
• 可以测量空气中含有直径为0.3～5μ m微粒的各种浓度，
测量比较准确，但它的粒子数量包含灰尘和细菌等多种微 粒，不能测量空气活菌数。
二、空气除菌方法
生产上使用的空气量大，要求处理的空气设备简单，
② 染菌率低，平均低于10~15％；
③ 除水、除油的效果好；
④ 耗电少。 • 缺点是设备庞大，需要采用高压电技术，且一次性投资较 大；对发酵工业来说，—其捕集率尚嫌不够，需要采取其 它措施。
4、介质过滤
• 介质过滤是目前发酵工业上常使用的空气除菌方法。它采
用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物
• 0.1—常数，其量纲为μ m。
3、空气含菌量的测定
• 培养法
– 平皿落菌法（沉降－平板法）
– 撞击法（有缝隙采样器、筛板采样器和针孔采样器）
– 过滤法
• 光学法
– 粒子计数器 • 利用微粒对光线散射作用来测量粒子的大小和 含量。
• 测量时使试样空气以一定速度通过检测区，仪
器内的聚光透镜将光源来的光线聚成强烈光束 射入测检区，在测检区内，空气试样受到光线 强烈照射，空气中的微粒把光线散射出去，由 聚光透镜将散射光聚集投入光电倍增管，将光
生碰撞，此时在气流的任一处，微 粒也随气流改变运动方向绕过纤维 前进，即b＝0，惯性力的无因次 准数φ ＝1／16，纤维的碰撞滞留
简述无菌空气的制备流程
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无菌空气制备
第六章空气除菌的工艺及设备
在发酵工业中，绝大多数是利用好气性微生物进行纯种培养，空气则是微生物生长和代谢必不可少的条件。但空气中含有各种各样的微生物，这些微生物随着空气进入培养液，在适宜的条件下，它们会迅速大量繁殖，消耗大量的营养物质并产生各种代谢产物；干扰甚至破坏预定发酵的正常进行，使发酵产率下降，甚至彻底失败。因此，无菌空气的制备就成为发酵工程中的一个重要环节。空气净化的方法很多，但各种方法的除菌效果、设备条件和经济指标各不相同。实际生产中所需的除菌程度根据发酵工艺要求而定，、既要避免染茵，又要尽量简化除菌流程，以减少设备投资和正常运转的动力消耗。本章将讨论合理选择除菌方法，决定除菌流程以及选用和设计满足生产需要的除菌设备等。
第一节空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求一、无菌空气的概念发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。
二、空气中微生物的分布
通常微生物在固体或液体培养基中繁殖后，很多细小而轻的菌体、芽孢或孢子会随水分的蒸发、物料的转移被气流带入空气中或粘附于灰尘上随风飘浮，所以空气中的含菌量随环境不同而有很大差异。一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；地面又比高空的空气含菌量多。因此，研究空气中的含菌情况，选择良好的采风位置和提高空气系统的除菌效率是保证正常生产的重要内容。
各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103~104个／m3进行计算。
发酵工程第四章无菌空气的制备
李 先 磊
化学化工系
2、辐射灭菌法
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
各种射线级超声波等理论上都能破坏微生物细胞
结构，从而起到杀菌作用。 辐射灭菌仅用于表面灭菌和有限空间灭菌。 应用最广泛的是紫外线灭菌，常与甲醛蒸汽一起 结合进行灭菌。
李 先 磊
化学化工系 3、静电除菌法
一． 空气过滤除菌的原理
二． 空气过滤除菌的介质
三． 介质过滤的效率 四． 影响过滤除菌效果的因素
五． 提高过滤除菌效率的措施
李 先 磊
化学化工系
三、介质过滤效率
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
滤层所滤去的微粒数与原有微粒数之比称为过滤效率， 用表示 ，是衡量过滤设备过滤能力的指标。
李 先 磊
化学化工系
3、布朗运动
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
直径小于1m的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则 的直线运动，即布朗运动。 使较小的颗粒凝聚为较大颗粒，随即可能产生重力沉 降或被过滤介质截留；
气流速度大时，凝聚现象为惯性碰撞所取代
李 先 磊
=
N1 －N2
N1
= 1－
N2
N1
= 1－P
N1— 过滤前空气中的微粒含量 （个）；
5第五章-无菌空气的制备
5 吸附截留效应
悬浮在空气中微生物和其他微粒具有一定 的电荷和极性性质，当干燥空气通过非导 体介质时，由于摩擦作用易产生电荷使介 质带电。当微生物及其他微粒与介质电荷 相异时，这些微粒就容易在这种静电吸附 作用下被介质截留。当微粒通过一些比表 面积大的活性介质如活性炭等时，由于范 德华力的作用，微粒被介质表面吸附而截 留。这些都属于吸附截留效应。
第二节 Leabharlann Baidu见的过滤介质
过滤介质是空气过滤除菌的核心因素。
过滤介质的选择不仅要考虑过滤效果，还要 考虑过滤所引起的空气压力损失、耐热消毒 灭菌情况、运行可靠性、使用和维护成本等 因素。
好的过滤介质不仅有良好的过滤效果，且由 于过滤阻截导致的空气压降损失较小，能够 耐受一定周期内消毒灭菌措施，使用维护成 本较低，有良好的运行可靠性。
2 玻璃纤维
玻璃纤维主要是由硅酸盐玻璃通过特殊拉 丝工艺制成的超细纤维丝。
较细的纤维直径有利于过滤效率的提高， 但由于玻璃纤维结构强度较弱，长时间使 用容易因为气流的冲击作用而断碎、堵塞， 影响过滤效果。在实际使用中，玻璃纤维 的装填密度不宜过高，此外散装的玻璃纤 维装填工作强度较大，装填过程困难，一 般使用预装填的玻璃纤维过滤装置。
二、颗粒活性炭过滤介质
活性炭的主要过滤原理是表面吸附截留作用， 因此空气过滤使用的活性炭颗粒 要求比表面 积大，颗粒均匀，结构强度好。
无菌空气的制备
常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘 空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。
但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，
当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微
粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而
沉降，所以静电除尘对很精选小PPT的微粒效率较低。
19
4．过滤除菌法
是目前发酵工业中经济实用的空气除菌方法， 是采用定期灭菌的介质来阻截流过空气所含的微生 物，而取得无菌空气的。
Baidu Nhomakorabea
精选PPT
9
4）空气含菌量测定 难以准确测定，一般采用培养法和光学法。
目前我国采用Y-09－1型粒子计数器，是利用微 粒对光线散射作用来测量粒子大小和数量的。总 菌数的测定；重叠细菌则难以测准。
精选PPT
10
三、空气的除菌方法
空气除菌就是除去或杀灭空气中的微生物。 破环生物体活性的方法较多，如辐射杀菌、加 热杀菌、化学药物杀菌，都是将有机体蛋白质变性 而破坏其活力。而静电吸附和介质过滤的方法是把 微生物的粒子用分离方法除去。
精选PPT
5
二、 发酵对空气无菌程度的要求
1、好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气 要作到绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济 的。 2、不同的发酵，由于所采用菌种的生长能力强弱、 生长速度的快慢、分泌物的性质、发酵周期的长 短、培养物的营养成分和PH值的差异，对所用的 无菌空气的无菌程度有不同的要求。
制备无菌空气的流程
制备无菌空气的流程
Preparing sterile air is a critical process in various industries, including pharmaceuticals, food processing, and healthcare. 通过消除空气中的微生物和有害粒子来制备无菌空气对于确保产品质量至关重要。There are several steps involved in the preparation of sterile air, which require careful attention to detail and adherence to strict protocols.
The first step in preparing sterile air is to clean the air intake to remove any dust, dirt, and other contaminants. 空气进入系统之前的清洁至关重要，以确保在空气进入处理过程之前从根本上减少微生物和颗粒污染。This may involve the use of filters, air purifiers, and other air cleaning technologies to ensure that the incoming air is free from any potential contaminants.
After the air intake has been cleaned, the next step is to sterilize the air using methods such as UV radiation, chemical disinfection, or heat treatment. 无菌化的方法可能包括使用紫外线辐射杀菌、化学消毒剂或热处理等。 Each method has its own advantages and limitations,
发酵工程 第4章 无菌空气的制备
空气流速大时，惯性冲击就起主导作用。
3、拦截滞留作用
气流速度降到临界速度以下，微粒不能因惯性 碰撞而滞留于纤维上，捕集效率下降。
本节小结
空气除菌即除去或杀灭空气中的微生物。
灭菌方法： 1、介质过滤除菌法 2、加热灭菌 3、静电除菌 4、辐射灭菌等
第2节 空气的过滤除菌原理和过滤介质
过滤除菌是发酵工业中广泛使用的空气除菌法。
按除菌的机制不同分为： 绝对过滤和深层介质过滤
绝对过滤：
采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5μm， 多限于实验室使用。
离地面越高，含菌量越少；一般每升高10米，空气 中的含菌量就降低一个数量级。
城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量较 少，一般城市空气中杂菌数为1000~10000个／m3。
空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有 酵母，霉菌和病毒（p91表4-1）。这些微生物大小 不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。
证纯种培养，必须将空气中的微生物除去 或杀死。 无菌空气是从发酵罐的底部进入，从顶部 排出，进入的空气要具备一定的压力—— 空气压缩机。
一、空气中的微生物
空气中微生物的含量和种类，随地区、季节和空气 中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而异。
一般潮湿温暖的地区和季节，空气中的微生物数量 较多。
各种除菌机制示意图
第二章 无菌空气的制备及除菌设备概论
2.压缩空气预处理原理
湿含量（X）
湿空气中水汽的重量与湿空气中干空气 的重量之比
P：某一状态时空气的压力
2.压缩空气预处理原理
若空气的湿含量x及温度T不变，空气的 压强愈大相对湿度也越大
3.压缩空气除水原理
相对湿度
Φ＝100% Φ＞100% Φ＜100%
达到饱和(对应温度为露点温度) 有水析出 无水析出
染菌原因
1．种子染菌 2．接种子罐压跌零 3．培养基灭菌不彻底 4．总空气系统带菌 5．泡沫升至罐顶 6．夹套穿孔 7．蛇管穿孔渗漏
所占百分比%
9．64 0．19 0．79 19．96 0．48 12．36 5．89
染菌原因
8．接种管道渗漏 9．阀门泄漏 10．搅拌轴封泄漏 11．罐盖泄漏 12．其它设备泄漏 13．操作问题 14．原因不明
第2节 压缩空气的预处理原理
1、压缩空气预处理的目的 2、压缩空气预处理原理 3、压缩空气除水原理
1.压缩空气预处理的目的
保证通气发酵用无菌空气的质量指标
2.压缩空气预处理原理
相对湿度
衡量空气中水汽偏离饱和程度的大小, φ =100% 空气达到饱和，对应的温度为露 点温度
PW：空气中水汽的分压 PS：与空气同温度的水汽的饱和蒸汽压
所占百分比％
0．39 1．45 2．09 1．54 10．15 10．15 24．91
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培养基配制
种子扩大培养 培养基灭菌
发酵设备
发酵生产
灭菌及下无菌游空气处的制理备
第五章 灭菌及无菌空气制备
• 发酵工程无菌技术：
– 纯培养发酵技术：发酵全过程只有生产菌，无杂菌
• 在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：
– 杂菌污染使基质或产物被杂菌消耗，造成生产能力下降； – 杂菌产生的某些代谢产物，改变了培养液的理化性质，使提取精
灭菌及无菌空气的制备
在计算灭菌时间过程中需考虑两个问题： 一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计
算依据； 二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即
1000次灭菌中有一次失败。
灭菌及无菌空气的制备
二、影响培养基灭菌的其它因素
除了灭菌温度和时间外，影响灭菌效果的因素还有：
1．培养基 pH值 ：
适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 • 例如：实验室内的高压蒸汽灭菌、发酵车间采用的
设备空消和培养基实消。
灭菌及无菌空气的制备
过滤介质除菌法
• 过滤介质除菌
– 采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过 滤，去除微生物的方法。
– 液体：0.22μm或0.45μm滤膜 – 气体：纤维介质滤材捕捉极微小的悬浮微生物
灭菌(sterilization)：用物理或化学方法杀死或除去物料、 空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子。
关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。
灭菌及无菌空气的制备
常用消毒、灭菌原理与方法
• 化学药剂消毒：甲醛或新洁尔灭、高锰酸钾等
– 使蛋白质凝固变性、酶失活；破坏细胞膜；
10%
120℃, 1. 5min
99.99%
5%
灭菌及无菌空气的制备
在确定了培养基灭菌的温度后，如何来计 算灭菌时间？
t 2.303logNo
k
Nt
t: 发酵培养基的灭菌时间
k: 比死亡速率，min -1,不同微生物在某一温度下的k值差异
N0: 开始灭菌时培养基物料中的活菌数，污染程度
Nt: 培养基经灭菌时间t后中的残留活菌数（灭菌程度一般为0.001， 即1000次有一次失败），灭菌程度
制发生困难； – 杂菌可能会降解目的产物，使得生产过程失败； – 杂菌会污染最终产品； – 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象，使生产失败
灭菌及无菌空气的制备
➢ 为了保证培养过程的正常进行，在接种要培养的微生 物之前，需要进行灭菌与消毒。
灭菌对象：培养基；设备与管道；空气系统；流加料、消泡剂； 必要时还有对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体
灭菌及无菌空气的制备
一、培养基的灭菌温度选择
用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间 对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既 能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时 间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。
培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都符合Arrhenius Equation方程:
• 工业上具体措施包括：
– 1）使用的培养基和设备须经灭菌； – 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理 – 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； – 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； – 5）使用无污染的种子。
灭菌及无菌空气的制备
• 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具 内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。 一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60℃，30min）。
k值/min-1
枯草芽孢杆菌FS5230 硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518 硬脂嗜热芽孢杆菌FS617 产气梭状芽孢杆菌PA3679
3.8~2.6 0.77 2.9 1.8
灭菌及无菌空气的制备
随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反 应速度常数增加的倍数。
• 达到相同灭菌效果时，温度T越高，K值越大（比死亡速率常数），所需 灭菌的时间t 越短。
适用范围：对压缩空气制备无菌空气；酶溶液、啤酒 及其他不耐热化合物溶液除菌。
灭菌及无菌空气的制备
第一节 培养基和发酵设备的灭菌
高压蒸汽灭菌利用饱和蒸汽的高温杀死微生物的同时， 高温还可能造成培养基成分的损失。
培养基灭菌的要求： • 达到要求的无菌程度 • 尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的
培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH值越低，所需杀 灭微生物的温度越低。pH6.0-8.0时最难灭菌。
pH值对灭菌时间的影响
温度 （℃）
120 115 110 100
微生物
反应速度常数增加的倍数
K值为比死亡速率
灭菌及无菌空营气养的制成备分
反应速率常数
k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。
T相同，k值越小，则微生物越是耐热。
同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小， 温度越高，k值增大。
细菌芽孢名称
Байду номын сангаас
121℃某些细菌芽孢的k值
• 在实际生产中为了既达到灭菌目的又较好地保存营养成分，最好采用较 高的温度，较短时间进行灭菌，瞬时高温灭菌UHT。即可达到杀死培养 基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。
• 通常情况选择灭菌温度为121℃，当培养基中含热敏成分，则降低温度
微生物
营养成分
芽孢
VB2
118℃, 15min
99.99%
• 物理方法
– 辐射灭菌：紫外线、X射线，高能辐射与菌体核酸光化学反应 – 干热灭菌法：氧化作用、高温使蛋白质变性和电解质浓缩中毒 – 湿热灭菌法（最常用）：蒸汽热使蛋白质变性，大分子氢键收到
破坏；
– 过滤介质除菌√：微生物不能透过滤膜而除菌
灭菌及无菌空气的制备
湿热灭菌法
• 蒸汽具有强的热穿透力，灭菌易于彻底，效果最好，应用 饱和蒸汽进行灭菌最为普遍。
破坏，是由两个基本类型的反应引起的： – 培养基中不同营养成分间的相互作用； – 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解
• 合理选择灭菌条件的关键：了解灭菌温度、时间对微生物
死亡和培养基成分破坏的关系。
灭菌及无菌空气的制备
致死温度：杀死微生物的极限（最低）温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成为致死时间； 在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。