序列形成i-Motif四聚体的电喷雾质谱分析

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的结构形式存在,改变基因或蛋白的功能[8,9]㊂所以,i -Motif 结构具有特殊的生物学意义,并具有广泛的应用潜力㊂由d (TC n )序列形成的i -Motif 结构是i -Motif 结构种类中最简单的四聚体,故引起较多的关注,然而用质谱的方法研究各种因素对i -Motif 形成的影响鲜为报道㊂最近,Leroy 利用NMR 研究了d (TC n )序列形成i -Motif 结构动力学过程,指出四分子i -Motif 是由单分子逐级结合形成[10]㊂本研究采用电喷雾质谱研究了乙酸铵缓冲溶液条件及序列长度等因素对形成四链i -Motif 结构的影响㊂电喷雾源是一种特别软的电离源,可以在质谱的气体相保留溶液中形成的非共价相互作用并使被测生物大分子带多电荷[11]㊂本研究通过电喷雾离子阱质谱检测由d (TC n )序列形成的i -Motif 四聚体的[4M]x -峰,利用测定的四聚体峰的相对强度来评价四聚体形成的难易和稳定性㊂然而,当四链的[4M]x -离子带偶电荷(x =2,4,6),[4M]x -峰将与[M]-和[2M]2-峰重叠,所采用的质谱的分辨率不足以区分上述离子,所以只用[4M]x -带奇电荷峰(x =1,3,5)辨别是否生成i -Motif 四聚体㊂d (TC n )序列质谱分析显示:序列的碱基数<5,带3电荷的四聚体被检测出;序列的碱基数>5,带5电荷的四聚体被检测出㊂[4M]x -的相对强度(RI [4m ]x -)用公式(1)计算得到㊂RI [4m ]x -=I [4M]x -I allˑ100%(1)第40卷2012年6月分析化学(FENXI HUAXUE ) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第6期932~9352 实验部分2.1 试剂与仪器实验所使用的核酸序列:d (TC 3),d (TC 4),d (TC 5)和d (TC 6)由大连TaKaRa 宝生物工程有限公司提供,使用之前未进一步纯化㊂甲醇(色谱纯,北京化工厂);冰醋酸(色谱纯,天津市福晨化学试剂厂);乙酸铵(分析纯,北京化工厂)㊂实验用水为Milli -Q 级纯水(美国Millipore 公司),电阻率为18.2M Ω㊃cm ㊂G6300Trap 质谱仪(美国Agilent 公司),使用Agilent 6300Ion Trap LC -MS 数据分析软件记录数据和分析质谱图㊂2.2 实验方法将样品配制成浓度约为2mmol/L 的储备液,于-18ħ保存㊂DNA 的准确浓度根据在260nm 测定的吸光度和摩尔吸光系数(/country.aspx )计算获得㊂将DNA 样品溶于一定浓度的醋酸-醋酸铵缓冲溶液中,在90ħ水浴中加热10~15min ,室温冷却,于-4ħ保存24h ㊂进入质谱前加入适量甲醇㊂改变缓冲溶液浓度,DNA 浓度或甲醇含量,测定形成四分子结构的相对强度㊂使用电喷雾离子源,在负离子模式下对仪器条件进行优化㊂实验所采用主要仪器参数为:Capillary,3600;Capillary Exit,-100;Skimmer,-15;Nebulizer,10.34kPa;Dry gas,5L/min;Dry Tempreture,325ħ㊂直接进样,进样流速5m L/min ,每次采集时间为1.0min ㊂3 结果与讨论3.1 d (T C 5)浓度对形成[d (T C 5)]4的影响在DNA 单链浓度为40~200m mol/L 范围内,考察了d (TC 5)序列浓度对形成[d (TC 5)]4四聚体离子相对强度的影响㊂理论上,在相对稀的溶液中,DNA 分子越多,相互碰撞结合 成核 的机会越大,也就越 图1 80m mol/L d (TC 5)的质谱图Fig.1 Mass spectrum of 80m mol/L d (TC 5)容易形成多聚体㊂从动力学角度考虑,DNA 浓度越大,形成多聚体的速率越快㊂在本研究的浓度范围内,随着DNA 浓度的增加,测定的四链峰相对峰强度在39.60%ʃ1.13%范围内,未发生明显变化,这可能是因为在这一浓度范围内形成四链结构已经达到饱和,因此进一步增加浓度将不改变反应的平衡㊂图1为80m mol/L DNA 单链浓度条件下测得到[d(TC 5)]4的质谱图㊂为节省样品并得到重现性好的谱图,取80m mol/L DNA 单链进行质谱分析㊂3.2 缓冲溶液浓度对[d (T C 5)]4的影响富含G 的序列形成G 四链结构,通常需要镶嵌在两个4G 平面中间的一价阳离子稳定G 四链体结构[3,12]㊂i -Motif 结构虽然不需要阳离子的嵌入,但是同样需要一定浓度的盐去中和磷酸骨架上的负电荷㊂考察了NH 4OAc -HOAc 缓冲溶液浓度变化对i -Motif 四聚体形成的影响㊂如表1所示,在不同浓度的缓冲溶液中,几种离子的相对强度发生了明显变化㊂随着缓冲溶液浓度的增大,[M]3-,[2M]3-,[3M]4-峰强度逐渐降低,[4M]5-峰强度逐渐增大,直到达到最佳缓冲溶液浓度(20mmol/L )后,四链峰强度开始下降㊂可以推测,在较低的盐溶液中,[M]n -上的负电荷未被抵消,很容易形成多电荷离子㊂因此,在质表1 在不同浓度的乙酸铵缓冲溶液下d (TC 5)序列形成各种分子离子峰相对强度Table 1 Intensities of various molecular ions formed by oligonucleotide (d (TC 5))at different concentrations of buffer solution 浓度Concentration (mmol/L )M 3-(%)M 2-(%)M -(%)2M 3-(%)3M 4-(%)4M 5-(%)浓度Concentration (mmol/L )M 3-(%)M 2-(%)M -(%)2M 3-(%)3M 4-(%)4M 5-(%)0.128.1046.74 2.6212.29 6.13 4.01200.7842.4224.347.980.9724.41114.3832.918.2316.029.2319.24500.5452.1723.535.460.9618.33339第6期秦玉娇等:d (TC n )序列形成i -Motif 四聚体的电喷雾质谱分析谱图的低质量端产生离子峰;此外,在较低的离子强度下,难于形成四聚体;或由于四聚体负电荷密度大,形成的四聚体不稳定,而随着NH 4+浓度的增大,双链和三链峰强度降低,四链峰强度逐渐增加㊂可以观察到,在不同的溶液条件下四链峰形成是逐条链加合,最后形成四链多聚体结构的动力学过程,这与NMR 的研究结果相一致[10]㊂当缓冲溶液浓度超过最佳浓度值,较高的盐浓度就会使质子化的i -Motif 结构不稳定,使DNA 倾向于容纳更大负电荷密度的单链形式存在[3]㊂图2显示了[d (TC 5)]4相对强度随乙酸铵浓度变化曲线㊂由图2可见,最佳缓冲溶液浓度为20mmol/L ㊂3.3 甲醇含量对[d (T C 5)]4的影响由非共价相互作用力稳定的DNA 多聚体很不稳定,有机溶剂的存在可以使其结构被破坏;然而在纯水溶液中多聚体分子很难被离子化㊂因此,在质谱进样前向样品中加入适量甲醇以提高分析的灵敏度㊂图3显示了四分子[d (TC 5)]4的相对强度随甲醇含量的变化曲线㊂从图3可见,甲醇的最佳含量为30%(V /V )㊂ 图2 [d (TC 5)]4的相对强度随醋酸铵浓度变化曲线Fig.2 Relative intensity of [d (TC 5)]4v s concentration ofammonium acetate图3 [d (TC 5)]4相对强度随甲醇含量的变化曲线Fig.3 Relative intensity of [d (TC 5)]4v s volume ratio ofmethanol to water图4 d (TC 4),d (TC 5)和d (TC 6)序列形成四分子[4M]x -相对强度随pH 变化曲线Fig.4 [4M]x -intensity of d (TC 4),d (TC 5)or d (TC 6)v s pH values3.4 p H 值的影响富含C 碱基的序列形成i -Motif 四聚体结构的一个主要因素是胞嘧啶先质子化(CH +)与未质子化的C 形成C ㊃CH +碱基对,而质子化反应通常需要在酸性条件下进行㊂采用电喷雾质谱在pH 值2.5~9.0的乙酸铵缓冲溶液中测定了d (TC n )序列形成四分子[d (TC n )]4x -的相对强度(n =4,5或6)㊂图4显示了3个不同序列形成四分子[d (TC n )]4x -的相对强度随pH 变化曲线㊂由图4可见,d (TC 4),d (TC 5)和d (TC 6)均在pH 4.5左右形成最强的[d (TC n )]4x -峰;在接近中性的条件下,几乎没有四分子离子被检测出㊂因此,形成i -Motif 结构最佳的pH 范围应该为4.0~5.0㊂3.5 胞嘧啶C 长度的影响表2 d (TC 4),d (TC 5)和d (TC 6)序列在pH =4.5时形成四链峰[4M]x -的相对强度Table 2 Relative intensities of [4M]x -formed by sequeces d (TC 4),d (TC 5)and d (TC 6)at pH 4.5DNA oligomer I 4M 3-(%)I 4M 5-(%)d (TC 4)0.19ʃ0.04d (TC 5)0.49ʃ0.07d (TC 6)0.66ʃ0.22半质子化碱基对之间的相互插入稳定i -Motif结构㊂设想:如果C 碱基数增多,C 和质子化CH +的离子对将增加,插入的碱基对将增加,非共价作用力就会增强,形成的i -Motif 结构将更稳定㊂质谱测定结果与此设想一致㊂表2列出了在相同的溶液和仪器条件下由d (TC 4),d (TC 5)和d (TC 6)序列形成[4M]x -峰的相对强度和6次测定439 分析化学第40卷的相对标准偏差㊂同时分析了d (TC 3)序列,由于其形成的四链峰的相对强度低,这里没有给出数据㊂表2显示:d (TC n )序列中C 碱基数增多,四链峰强度明显增加,其中d (TC 5)比d (TC 4)增加了近30%,但是d (TC 6)比d (TC 5)只增加了15%,说明当序列碱基数达到一定值,继续增大C 碱基数目,四链峰强度增加不明显㊂3.6 小结本研究利用电喷雾质谱对d (TC n )序列形成i -Motif 四聚体进行分析,研究发现:缓冲溶液浓度为20mmol/L ,pH 4.0~5.0,甲醇含量30%为形成四聚体的最佳溶液条件㊂在最佳溶液条件下,d (TC n )序列形成四聚体结构的能力随着n 的增大而增强,其形成动力学过程是逐条链结合的过程㊂R e f e r e n c e s1 G i l b e r tDE ,F e i g o n J .C u r r e n t O p i n i o n i nS t r u c t u r a lB i o l o g y .,1999,9(3):305~3142 G u ér o n M ,L e r o y JL .C u r r e n t O p i n i o n i nS t r u c t u r a lB i o l o g y .,2000,10(3):326~3313 M i l l sM ,L a c r o i xL ,A r i m o n d oPB ,L e r o y J -L ,F r a n c o i sJ -C ,K l u m p H ,M e r g n y J-L .C u r r .M e d .C h e m .A n t i C a n c e rA ge n t s .,2002,2(5):627~6444 S o n g G T ,C h e n M.L ,C h e nC ,W a n g CY ,H uD ,R e n JS ,Q uX G.B i o c h e m i s t r y ,2010,92(2):121~1275 K a u s h i k M ,P r a s a d M ,K a u s h i kS ,S i n g hA ,K u k r e t i S .B i o p o l y m e r s ,2010,93(2):150~1606 C h e nL Q ,C a i L ,Z h a n g X H ,R i c hA.B i o c h e m i s t r y ,1994,33(46):13540~135467 A l b e r t i P ,M e r g n y JL .P N A S ,2003,100(4):1569~15738 S a r i g G ,W e i s m a n -S h o m e rP ,E r l i t z k iR ,F r y M.J .B i o l .C h e m .,1997,272:4478~44829 M a r s i c hE ,P i c c i n iA ,X o d oL .E ,M a n z i n iG.N u c l e i c .A c i d s .R e s .,1996,24(20):4029~403310 L e r o y JL .N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h .,2009,37(12):4127~413411 M e n g ZJ ,S i mm o n s -W i l l i sT A ,L i m b a c hPA.B i o m o l e c u l a r E n g i n e e r i n g ,2004,2:1~1312 W i l l i a m s o n JR.A n n u .R e v .B i o p h ys .B i o m o l .S t r u c t .,1994,23:703~730O l i g o n u c l e o t i d eF o r m i n g Te t r a m o l e c u l a r i -M o t if S t r u c t u r e S t u d i e db y E l e c t r o s p r a y I o n i z a t i o n M a s s S p e c t r o m e t r yQ I N Y u -J i a o ,W E I S h i -G a n g ,L I UZ h e n g -S h u a n g ,WA N GB i n g ,G U O X i n -H u a *(C o l l e g e o f C h e m i s t r y ,J i l i nU n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n 130012,C h i n a )A b s t r a c t C y t o c i n e (C )r i c h D N A s e q u e n c eo l i g o n u c l e o t ide (d (T C n ))c a nf o r m p a r a l l e ld u p l e x t h r o u g h t h e i n t e r a c t i o n s o f Ca n d p r o t o n a t e dC H+b a s e p a i r a n d t w o p a r a l l e l d u pl e x e s i n t e r c a l a t e i n t o e a c ho t h e r i nah e a d t o t a i l o r i e n t a t i o nt oa d o p t a f o u r -s t r a n d e d i -M o t i f s t r u c t u r e .I nt h i s s t u d y ,t h e t e t r a m o l e c u l a r i o n sf o r m e db y t h es e q u e n c ed (T C n )a r e m e a s u r e db y e l ec t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y ,a n dt h ei n f l u e n c e o fs o l u t i o n c o nd i t i o n sa n d c y t o c i n ele n gt h o nt h ef o r m a t i o n o f t e t r a m o l e c u l a r i -M o t i f ,a r e i n v e s t i g a t e d .T h e r e s u l t s s h o wt h a td (T C 5)s e q u e n c e i nab u f f e r s o l u t i o n c o n t a i n i n g 20mm o l /La mm o n i u ma c e t a t ea n d30%m e t h a n o lw i t h p H4.0-5.0g e n e r a t e s t h em o s t a b u n d a n t t e t r a m o l e c u l a r i o n .I n c r e a s i n g nn u m b e r s o f t h ed (T C n )(w h e r env a r i e s f r o m3-6)f a v o r s t h e f o r m a t i o no f t h e t e t r a m o l e c u l a r i -M o t i f .K e y w o r d s E l e c t r o s p r a r y i o n i z a t i o n -i o nt r a p m a s ss p e c t r o m e t r y ;T e t r a m o l e c u a l r i -M o t i fs t r u c t u r e ;O l i g o n u c l e o t i d e s e qu e n c e ;C ㊃C H +b a s e p a i r (R e c e i v e d 5J u l y 2011;a c c e pt e d 27O c t o b e r 2011)539第6期秦玉娇等:d (TC n )序列形成i -Motif 四聚体的电喷雾质谱分析。