Trizol法提取普通小球藻总基因组DNA
Trizol提取DNA
用Trizol提取DNA1、将残留在中间相上层的水相全部移除，这对于提取的DNA的质量至关重要，2、均一化时，每1ml的trizol试剂中加300ul 100%的乙醇，3、盖盖，多次颠倒样本混匀4、室温下孵化样本2-3min5、 4 ℃下以2000xg离心5min6、将酚-乙醇上层液移除，如果要求提取蛋白就将上层液移到一个新的管中。
上层液可以在-70℃条件下保存几个月。
7、继续用DNA洗脱步骤洗脱DNA颗粒1)每1mltrizol试剂用1ml柠檬酸钠或者乙醇溶液（10%乙醇加入0.1M的柠檬酸钠，PH 为8.5）用于初步均化2)室温下孵育30min,偶尔轻柔的颠倒混合物，（注意：DNA可以储存在柠檬酸钠和乙醇溶液中至少2小时）3) 4 ℃下以2000xg离心5min孵育，移除和废除上清液4)重复洗脱（步骤1-3）注意：大的DNA颗粒（>200ug）重复洗脱两次5)每1ml trizol试剂加1.5-2ml的75%的乙醇，用于均化（注意DNA样本可以储存于4 ℃下的75%乙醇几个月）6)室温下可以孵化10-20min,偶尔轻柔的颠倒混匀管7) 4 ℃下以2000xg离心5min孵育，移除和废除上清液8)通过空气或者真空干燥DNA颗粒5-10min。
不允许DNA颗粒太干燥，不要通过真空离心干燥DNA颗粒。
9)重悬浮DNAa)每50-70mg的组织或者1*107的细胞加8Mm的NAOH0.3-0.6ml。
（注意：因为提取的DNA在水或者Tris缓冲液中不能很好地重新混匀，强烈建议在弱碱条件下悬浮DNA）b)4 ℃下以12000xg离心样本10min，来移除任何不溶的材料c)将包含DNA的上清液转移至一个新的管中，用HEPES来调节需要的PH，进行下游选择的应用。
DNA可以在4 ℃下储存过夜，但是为了长期存储，用HEPES调节PH至7-8，加1mM的EDTA,储存在4 ℃或者20 ℃下。
3种小球藻DNA提取方法的比较
收稿 1999206216 修定 2001202226 1 国家自然科学基金(39870561)和“九五”国家科技攻关(962C02204205)资助项目。
3种小球藻D NA 提取方法的比较1陈 颖 刘根齐 李文彬 孙勇如(中国科学院遗传研究所,北京100101)Comparison of Three Extraction Methods for D NA from Chlorella spp.CHEN Y ing ,L IU G en 2Qi ,L I Wen 2Bin ,SUN Y ong 2Ru (Institute of Genetics ,The Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100101) 提要 单细胞真核藻类小球藻已成为藻类分子生物学研究的热点,但其特殊的细胞壁组分给DNA 的提取带来了一定的困难。
文章比较了3种从小球藻中提取DNA 的方法,即纤维素酶法、作者改进的CTAB 法和目前单细胞藻类常用的裂解法。
通过所提取的DNA 进行浓度、纯度分析,认为CTAB 法是一种简单、快速和高效的适合于小球藻的DNA 提取方法。
关键词 椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea ) DNA 提取方法 CTAB 法 作为单细胞真核藻类的小球藻因其结构简单、生长迅速、营养丰富,又可食用,目前正逐渐成为藻类分子生物学及基因工程研究的热点。
但由于其细胞壁的组分和结构较为特殊[1～4],细胞壁外层还含有可抑制多糖酶降解作用的孢粉质(sporopol 2lenin )[5],给小球藻DNA 的提取带来一定困难,从而影响了小球藻基因工程的深入研究。
要想获得高产量与高质量的DNA ,关键问题在于细胞壁的充分降解与破碎。
目前虽然已有几种小球藻藻体中DNA 的提取方法,但有些较为复杂,有些提取效果不佳[6,7]。
本文采用纤维素酶法和作者改进的CTAB 法与目前单细胞藻类常用的超声波处理法相比较,通过对提取的DNA 进行浓度、纯度分析,以期得到一种简单、快速、高效提取小球藻DNA 的方法。
2种微藻总RNA提取方法的比较
Abstract To select the optimum extraction method for total RNA from microalgae, Trizol method and SDS-LiCl method were used with Chlamydomonas reinhardtii and Micractinium pusillum as materials. The results showed that, high-quality RNA from M. pusillum was obtained by using SDS-LiCl method. In contrast, both Trizol method and SDS-LiCl method were suitable for total RNA extraction from C. reinhardtii. However, the former is more simple and efficient than the latter. The RT-PCR results showed that total RNA isolated from M. pusillum by using SDS-LiCl method and from C. reinhardtii by using Trizol method could be directly used for molecular biology experiments， such as molecular cloning and gene expression analysis. Keywords Chlamydomonas reinhardtii ; Micractinium pusillum ; RNA extraction; SDS-LiCl method ; Trizol method
TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质
TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR 和酶切。
蛋白质可用于Western Blotting。
规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项
TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。
接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。
若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。
收到药品后，在室温下存储。
以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。
说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。
该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和Sacchi的RNA一步抽提法。
在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。
离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。
RNA只留在水相中。
转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。
除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。
用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。
DNA 的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。
这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。
其简单的操作方法允许同时处理大量样品。
整个过程可在1小时内完成。
用TRIZOL提出的总RNA 不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。
TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。
例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA 条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA 的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。
所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。
谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。
由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。
Trizol法提取RNA、DNA及蛋白质
Trizol法提取RNA、DNA及蛋白质1、向组织或细胞中加入1ml TRIZOL，吹打混匀，室温静置5min；2、加入TRIZOL 1/5(200ul)氯仿，振荡混匀，室温静置3min，4°C 12000g离心15-20min；注：上层水相可以通过异丙醇沉淀RNA，中间层通过乙醇能使DNA沉淀析出，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。
RNA提取3、将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 minutes;4、4°C，然后离心12,000 g ，10 minutes，去上清留沉淀；5、加入1ml 75%乙醇（RNase-free）洗涤沉淀，votex 5s；6、4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去上清留沉淀；7、加入1ml无水乙醇洗涤，votex 5s ，4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去废液留沉淀；8、晾干；9、加入50ulRNase free ddH2O溶解；10、测浓度，-80℃保存。
DNA提取3、将上层水相转移干净，这对分离DNA很关键；4、加入300ul无水乙醇/1ml TRIZOL，颠倒混匀，室温静置3min；5、4°C，2,000 g ，离心5 minutes；6、转移上清液，用于蛋白提取；7、加入1ml柠檬酸钠/无水乙醇（0.1M柠檬酸钠10%乙醇，pH8.5）洗涤，室温孵育30min（不时轻轻颠倒混匀）；8、4°C， 2,000 g ，离心5 minutes，去废液留沉淀；9、重复步骤7和8；10、加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀，室温孵育10-20min（不时轻轻颠倒混匀）；11、4°C， 2,000 g ，离心5minutes，去上清留沉淀；12、无水乙醇洗涤，votex 5s，4°C， 2,000 g ，离心10 minutes；13、晾干；14、加入50ul ddH2O或TE溶解，测浓度，冰箱保存。
trizol法
trizol法
Trizol法是一种常用的分离和提取核酸的方法，它可以有效地分离和提取DNA、RNA和蛋白质。
Trizol法是由美国公司GIBCO BRL公司开发的，它是一种三步法，可以有效地分离和提取核酸。
Trizol法的第一步是细胞悬液的混合，将细胞悬液加入Trizol液中，然后混
合均匀，使细胞膜破裂，释放出细胞内的核酸。
第二步是沉淀提取，将混合液加入乙醇，使核酸沉淀，然后用离心机将沉淀物
收集，再用热水浴将沉淀物稀释，最后用离心机将沉淀物收集，得到提取的核酸。
第三步是提取液的清洗，将提取液加入苯乙醇，使蛋白质沉淀，然后用离心机
将沉淀物收集，再用热水浴将沉淀物稀释，最后用离心机将沉淀物收集，得到提取的核酸。
Trizol法是一种有效的分离和提取核酸的方法，它可以有效地分离和提取DNA、RNA和蛋白质，是研究基因的重要工具。
它的优点是简单、快速、高效，可以有效
地提取大量的核酸，是研究基因的重要工具。
trizol试剂法
Trizol试剂法是一种用于提取RNA的常用方法，其操作简单，可以同时处理多个样品，且提取的RNA无DNA 和蛋白质污染。
以下是其基本步骤：
1. 将细胞或组织样本磨碎，具体操作方法是将细胞或组织样本放入匀浆器中，加入Trizol试剂，通过反复
研磨来破碎细胞。
2. 加入氯仿，用力震荡后离心。
此步操作可使不同物质分相，将RNA留在水相中。
3. 将水相转移至新的EP管中，加入异丙醇后再次离心。
这一步可促进RNA沉淀。
4. 去除上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，最后让RNA在室温下自然干燥。
5. 用无RNA酶的水溶解RNA沉淀。
此外，Trizol试剂法提取RNA时，需注意以下几点：
1. 在收集到生物材料后应尽快进行RNA制备工作，以避免RNA降解。
2. 提取RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细
胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。
3. 提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于 Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分
析等。
请注意，对于不同类型和状态的材料，可能需要调整Trizol试剂法的具体步骤和参数。
因此，在实验过程中应根据实际情况进行调整。
TRIzol细胞基因组DNA的提取
TRIzol法细胞基因组DNA的提取准备试剂：TRIzol，氯仿，无水乙醇，0.1 M柠檬酸钠 (含10%乙醇)，75%乙醇，8 mM NaOH，0.1 M HEPES，0.1 M EDTA1. 样品中加入1 ml TRIzol，室温（15-30℃）放置5 min，使核酸蛋白符合物完全分离。
2. 每使用1 ml TRIzol加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3~5分钟使其自然分相。
3. 4℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层：底层黄色有机相，中间层和上层无色水相。
4. 样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。
每使用1 ml TRIzol加0.3 ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000 × g离心5分钟。
5. 移去上清，用含10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。
每用1 ml TRIzol 加入1 ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
6. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1 ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇，室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)，2-8℃ 2000 × g离心5分钟，弃上清。
7. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用200 μl 8 mM NaOH溶解DNA。
溶解DNA后加25 μl 0.1 M HEPES调节pH约为7.7，再加2.27 μl 0.1 M EDTA，置于-20℃长期保存。
(也可以用灭菌蒸馏水）实验所需但试剂未提供的物品：* 酒精* 0.1 M柠檬酸钠（用10%酒精配制）* 75%酒精8 mM NaOH如无例外，以下操作均应在15—30℃下完成。
1.DNA的沉淀移除中间层上残余的水样层，用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。
按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇，反复颠倒来混合样品。
藻类dna提取方法
藻类dna提取方法嘿，咱今儿就来唠唠藻类 DNA 提取这档子事儿！你想想啊，藻类，那可是在水里头到处晃悠的小家伙们，别看它们不起眼，要从它们身上把 DNA 弄出来，还真得有点招儿呢！首先呢，得把藻类给收集起来呀。
就好比你去果园摘果子，得先找到那些成熟的果子不是？把藻类收集到一块儿，这就是提取 DNA 的第一步。
然后呢，就得把藻类给弄碎咯。
哎呀，这就像是要把一个大面包掰成小块儿，得让里面的好东西都能露出来呀。
可以用一些特殊的工具或者方法，把藻类细胞给破开。
接下来呀，就是关键的一步啦！要把 DNA 从那些碎碎的藻类里面分离出来。
这就好像在一堆沙子里找金子，得有耐心，还得有合适的办法。
可以用一些化学试剂啥的，让 DNA 乖乖地跑出来。
再之后呢，得把 DNA 给纯化一下。
这就好比把淘到的金子再洗一洗，把杂质去掉，让它变得更纯更亮。
这样得到的 DNA 才更干净，更好用呀。
你可能会问啦，这有啥难的呀？嘿，可别小瞧了这事儿。
就跟做饭似的，看着简单，做起来可不一定容易呢。
要是哪个步骤没弄好，可能就得不到好的 DNA 啦。
比如说吧，收集藻类的时候要是不仔细，混进去了别的东西，那后面提取出来的 DNA 可能就不纯净啦。
或者在弄碎藻类的时候太大力气了，把 DNA 也给弄坏了，那不就白忙活啦？还有啊，选择化学试剂的时候也得小心谨慎，要是用错了试剂，可能 DNA 就提不出来，或者提出来的质量不好。
咱再打个比方，这就像是盖房子，每一块砖都得放对地方，才能盖出坚固漂亮的房子呀。
提取藻类 DNA 也是这样，每个步骤都得认真对待，才能得到好的结果。
总之呢，藻类 DNA 提取可不是一件随随便便就能做好的事儿。
得有耐心，得细心，还得有一定的技术和经验。
但是只要咱认真去做，肯定能从那些小小的藻类里把宝贵的 DNA 给弄出来！怎么样，是不是挺有意思的呀？咱可别小看了这些小小的藻类，它们里面藏着的秘密可多着呢！。
如何用Trizol抽提DNA（没错是DNA！）
如何用Trizol抽提DNA（没错是DNA！）我叫林平之，是万事屋著名的NPC，大家应该都认识，我是莫愁师姐的师弟。
最近抽提RNA经常会用DNA污染，导致qPCR扩增出来都不对，真是烦人！咋办，问问看神师兄吧。
神师兄：好，看你辣么乖，今天就教你怎么用Trizol来抽提DNA 吧。
是的，你没看错，就是用Trizol来抽提DNA。
小林子：师兄，我读书少，但我听远房姑表姨妈家的大师姐曾经说过，Trizol是用来抽提RNA的……神师兄：少年人，我读书多，不会骗你的。
Trizol里面的主要成分是酚，和一些胍盐，异硫氰酸胍和盐酸胍。
Trizol中酚是用来破碎细胞的，而胍盐用来抑制各种酶的活性。
用Trizol将细胞裂解后，再用氯仿将蛋白质变性后，萃取分层，离心后，就会变成这样：当Trizol的pH＜7的时候，抽提过程中，DNA会分离到下层的有机相中。
这就是为什么一般Trizol都会使用水饱和酚，而DNA抽提时要用Tris饱和酚了。
好了，废话不多说了，我们要怎么样才能用Trizol来抽提DNA呢？由于Trizol是酸性的，抽提时DNA都会分布到下层的氯仿有机相里面。
那我们采用乙醇将DNA沉淀，就能将有机相中的DNA进行沉淀了。
接着，我们用含有柠檬酸钠的乙醇来洗几次沉淀，就能顺顺利利地抽提到DNA了。
Trizol能抽提DNA，那当然也能抽提蛋白咯。
蛋白的话，用异丙醇来沉淀就能抽提到蛋白了。
但这些并不重要，重要的是，我们在使用Trizol抽提RNA的时候，要怎么样避免DNA污染呢？刚才也说了，当Trizol中pH大于7的话，就会导致DNA溶解进水相。
也就是说你的样本中如果存在有强碱性的物质，就有可能导致DNA污染。
同样，样本中如果含有DMSO或者乙醇之类的有机溶剂的话，也会导致Trizol抽提RNA的时候，有Genomic DNA污染哦！所以还是要小心呢！好了，今天就策到这里吧。
TRIzol法提RNA、DNA和蛋白质
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNATRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/ SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA勺完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA用乙醇沉淀中间层可回收DNA用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5X 106细胞）也适用于大量样品（》1g组织、＞107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA亏染，可用于Northern Blot , dot blot , ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNasel处理RNA羊品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA勺得率，也可用于PCR和酶切。
蛋白质可用于Western Blotti ng 。
规格：100ml黄色透明液体储存条件：2-8 C避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase?亏染注意事项：1. 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2. 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。
3. RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01 % v/v,放置过夜，高压灭菌。
TRIzol法提取步骤
TRIzol法提取步骤1、研磨：不多于0.1g植物材料。
2、抽提:向离心管中加人l ml TRizol，充分混匀，室温放置5min。
3、4℃12000rpm，离心10min。
取上清，转移到新的无RNase的新离心管中，加人0.2mL氯仿，盖好盖后，用手剧烈震荡15s，室温放置3min。
4℃11000rpm离心15min，样品分层，把水相约600ul转移至新管中。
5、沉淀:在得到的水相中加人500μl异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃11000rpm离心10min，去上清。
6、洗涤:加人lml75%乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min将75%乙醇用移液枪吸净，将离心管在超净工作台中吹干(大约3min)时间过长，RNA不易溶解，加人30μl无RNase水混匀溶解沉淀。
方法二：(1)取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移人1．5ml小指管；(2)立即加lml TRIzolReagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；(3)水平放置小指管室温孵育20min；(4)4 C，12000rpm，离心10min；(5)移澄清上清液人一新的1．5ml小指管中，加人0．2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1．5ml小指管15s，室温孵育2min-3min；(6)4 C，12000rpm，离心15min；(7)移最上层水相到新的1．5ml小指管中，加入0．25ml异丙醇、0．25ml 高盐混合液(O.8mol/l 柠檬酸钠+1.2mol/l NaCl)混匀，室温孵育30min；(8)4℃，12000rpm，离心10min；(9)弃上清，用lml 75％乙醇(用DEPC水来配)洗沉淀，涡旋混合样品，4℃，12000rpm离心5min；(1O)弃上清，短暂干燥RNA沉淀5min-10min，用RNase-free(DEPC处理过的)水溶解沉淀，-70℃保存，供以下实验使用。
不同营养方式下小球藻生长与光合作用的变化
不同营养方式下小球藻生长与光合作用的变化王超;孙春晓;乔洪金;丛超;王际英;张利民【摘要】Objective]The variation of growth and photosynthesis of microalgae was studied and compared under autotrophic condition and hetero-and mixotrophic conditions with acetate as carbonsource.[Methods]With Chlorella sorokiniana as material,the changes of growth and photosynthesis were reflected by determining the OD550 and the chlorophyll fluorescence from photosystem Ⅱ(PS Ⅱ).[Results]The growth rates of hetero-and mixotrophic conditions were significantly higher than that of autotrophic condition.It was only 1 .5 d for cells reaching sta-tionary phase under hetero- and mixotrophic conditions,but 9 d for cells under autotrophic condition.The parameters of chlorophyll fluo-rescence under autotrophic condition were signif-icantly higher than that under hetero-and mix-otrophic conditions,and that under mixotrophic condition were significantly higher than that un-der heterotrophic condition.The effective PS Ⅱquantum yield under mixo-and heterotrophic condition was reduced 21.5% and 98.1%,re-spectively,compared with that of autotrophic condition.The mRNA expression of Rubisco gene under mixotrophic condition were highest,and 3 .2-fold and 1 .8-fold of that under hetero-and autotrophic conditions,respectively.[Conclusion]The photosystems ofChlorella under mixotro-phic condition only slightly inhibited.In addition,the growth rate and maximal cell density un-der mixotrophic condition were higher than otherconditions.Therefore,mixotrophic growth mode is suitable for large-scale cultivation.%【目的】研究小球藻在自养条件下和以乙酸为碳源的异养、混养条件下生长以及光合作用的变化。
trizol法同时提取动物组织RNADNAPro实验步骤精简
trizol法同时提取动物组织RNADNAPro实验步骤精简Trizol法同时提取动物组织RNA/DNA/ProTrizol法提取组织RNA、反转录1、补足Trizol500uL，匀浆2、室温静置5 min，加入200 μL氯仿，用力震荡，室温静置3~5 min分层，4℃，8500rpm离心15 min3、吸取上清300uL，加氯仿200uL，重复24、吸取上清300uL，加异丙醇300uL，混匀，静置10min，室温静置过夜。
5、4℃，8500 rpm 离心15 min，沉淀RNA。
弃上清，RNA置于管底。
6、加入1 mL 75%乙醇，温和震荡，4℃，7500 g（5300rpm）离心5 min；弃上清，重复一遍；室温放置10 min晾干至沉淀半透明状。
7、DEPC溶解RNA8、RNA浓度（μg/mL）测定：A260 nm/280 nm 1.8~2.09、反转录在PCR管中加入25 μL体系反应第一步（反应总体积10 μL）混匀后，70℃，反应5 min，然后冰浴迅速冷却。
第二步（反应总体积15 μL）混匀后，37℃，反应60Min；再进行95℃，反应3 min，然后冰浴迅速冷却，-20 ℃保存。
Trizol法提取组织DNA1.完全吸弃RNA，余下DNA和蛋白2.加入300 μL 无水乙醇，混匀，放置2~3 min，4℃，2000 g （1417rpm），离心5 min沉淀DNA，将清液（蛋白质）吸至另一个离心管。
3.加入1 mL DNA洗涤液，混匀，室温放置30 min，此间经常震荡。
4℃，2000 g（1417rpm），离心5 min，弃上清。
（注：DNA 可以保存在DNA 洗涤液中2 h）。
4.重复步骤3的洗涤（若DNA样品很多>200 ug重复洗涤2次）。
5.加入1.5~2 mL 75%乙醇（2mL），混匀，室温放置10~20 min，此间经常震荡。
4℃，2000 g（1417rpm），离心5 min，弃上清。
Trizol提取RNA_DNA_PR步骤
Trizol提取RNA、DNA、蛋白质步骤1st step RNA的提取一、材料食管癌组织。
二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂耗材1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水(去离子水或MilliQ 的高纯水更好)，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、trizol4、氯仿5、手套、帽子、口罩6、1ml、100ul、10ul枪头、1.5ml和200ul EP管（DEPC处理过的）7、液氮8、甲醛1.2 DEPC水配制的3 M，pH5.2 的NaAc：在80 mL DEPC水中溶解40.8 克NaAc.3H20（Amresco公司），用冰乙酸调pH至5.2，定容到100 mL。
1.3 10×甲醛变性胶缓冲液[10×FA（formaldehyde agarose）gel buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA]：称6.8 克NaAc.3H20，溶于400 mL DEPC处理过的去离子水中，然后加20.9 克MOPs溶解，再加1.86 克EDTA二水二钠，用1 M灭菌的NaOH调pH至7.0（约用NaOH 40 mL）加DEPC处理过的水定容到500 mL，棕色瓶中室温避光保存。
1.4 5×加样缓冲液（5×loading buffer）：先配水饱和的溴酚兰液，在一只1.5 mL 离心管中加入约0.1 mg 溴酚兰，加入 1 mL DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚兰粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚兰液。
加入以下各种成分：4.00 mL 10×FA gel buffer3.84 mL 甲酰胺2.00 mL 100%的甘油720.00 μL 37%（约12.3 M）的甲醛80.00 μL 0.5 M 的EDTA（pH8.0）16.00 μL 水饱和的溴酚兰（若颜色太淡，可以加40 μL）100.00 μL DEPC 水分装1.5 mL 离心管，除常用的4℃保存外，其余-20℃保存。
TRIZOL试剂
TRIZOLTRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有1主要成分TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol 中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol 能保持RNA完整性。
加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
TRIzol2基本特点Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织（50-100 mg）和细胞（5×106）以及大量的组织（≥1 g）和细胞（>107）均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA （中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
trizol 使用说明书中文版
Trizol使用说明书一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、 料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、 璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Trizol法提取普通小球藻总基因组DNA
作者：段文斌金刚代建国张丽君栾崇林于化泓
来源：《江苏农业科学》2015年第07期
摘要：Trizol法主要应用于动植物RNA提取，由于其在提取RNA的过程中将DNA有效分离到有机相中，并且在有机相中DNA未被降解，因此本研究采用Trizol法提取具有细胞壁的普通小球藻的基因组DNA，发现提取得到的DNA纯度和产率高，且DNA完整性好。
经检测：D260 nm/D280 nm=1.86，平均得率为977 μg/g鲜质量；琼脂糖电泳检测其条带清晰，未发生降解。
该方法具有简单快速获得高纯度和高产率的小球藻基因组DNA的优点。
关键词：Trizol法；普通小球藻；DNA提取
中图分类号：S917 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0033-02
Trizol法最早由Chomczynski等提出，用于提取细胞或组织中的总RNA[1]。
经过Trizol处理过的样品，其总RNA、DNA及蛋白质分别分布在上层水相、中间层、下层有机相。
Trizol 试剂中含有的苯酚、异硫氰酸胍等物质，将细胞迅速破碎，并抑制释放出来的核酸酶，同时能够保持RNA、DNA的完整性，因此对RAN、DNA的同时提取纯化十分有用[2]，大大节约试验时间，提高试验效率。
小球藻（Chlorella vulgaris）作为一种单细胞绿藻，具有极强的光合自养能力；含有丰富的脂质、蛋白质、维生素、核酸、食物纤维、叶绿素等，都是人体健康不可或缺的营养物。
小球藻还生产多种生物活性物质[3]。
由于其脂类可以达到细胞干质量的10%～30%而被用于生产生物柴油[4-5]；通过转基因小球藻可以被用来生产病毒抗体[6]；也发现小球藻具有抗菌活性[7]；小球藻可以治理重金属、有机物以及氮磷污染[8]。
因此，科研工作者开始对小球藻进行深入研究。
本研究尝试使用Trizol法[9]提取小球藻基因组DNA，以期获得简单快速获取高纯度高产率基因组DNA的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
普通小球藻购自中国科学院典型培养物种保藏委员会海洋生物种质库，使用SE培养基培养，在三角瓶中培养，培养温度为25 ℃，光照强度条件为2 000 lx，光暗周期设置为12 h/12 h；培养至对数后期取样，试验前将普通小球藻4 ℃黑暗处理24 h，将细胞内储存的淀粉消耗掉，将有利于DNA的提取。
1.2 试剂
Trizol Reagent 购自Invitrogen公司，氯仿、无水乙醇及异丙醇均为国产分析纯，10 mol/L NH4Ac，TE（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值8.0），70%乙醇。
1.3 仪器
离心机：德国Eppendorf公司生产；凝胶成像系统：美国SYNGENE公司生产；核酸/蛋白分析仪；BECKMAN COULTER DU800；酶标仪：Thermo Fisher SCIENTIFIC。
1.4 试验步骤
将培养至对数期（D680 nm约为0.6[10]）的普通小球藻 300 mL 在1 500 g下离心5 min进行收集并称鲜质量（500～600 mg），用新鲜培养基重悬浮1次，并再次离心收集；加入 5 mL Trizol试剂，吹打混匀，转入玻璃匀浆器研磨10 min；加入1.5 ml氯仿，混合均匀，在10 000 g、室温下离心10 min，弃上层水相和中间变性蛋白层，吸取下层有机相至新的离心管中；加入等体积的无水乙醇沉淀DNA，-20 ℃静置10 min，10 000 g、室温下离心10 min；弃去上清，加入100 μL TE溶解管底的DNA沉淀，吹打混匀，加入40 μL 10 mol/L NH4Ac，混匀，4 ℃静置10 min，10 000 g、室温下离心10 min；吸取上清至新的离心管中，加入140 μL的异丙醇，混匀，-20 ℃放置10 min，12 000 g、室温下离心10 min，弃去上清；加入70%的乙醇洗涤2次沉淀，离心，吸去离心管底的液体，在室温下晾干5 min，加入80 μL TE溶液溶解DNA。
1.5 检验方法
使用1%的琼脂糖凝胶电泳分析以及核酸/蛋白分析仪测定其D260 nm、D280 nm及其比值；取5 μL溶有DNA的TE溶液稀释400倍后进行DNA浓度测定，并根据DNA浓度计算公式（DNA浓度=稀释倍数×D260 nm×50/1000）计算出浓度值，计算结果单位为μg/μL。
2 结果与分析
使用Trizol法提取普通小球藻基因组DNA，其紫外吸收光谱在260 nm、280 nm波长处都有吸收峰，D260 nm/D280 nm值为1.86，表明该方法提取得到的DNA样品没有蛋白质等其他杂质，纯度较高（表1）；并且具有高DNA产率，平均产率为977 μg/g鲜质量）。
从图1可以看出，琼脂糖凝胶电泳成像后的图像中点样孔处干净，表明并没有蛋白质污染；DNA条带单一，无拖尾及降解现象，说明所提取的DNA完整性好并且没有RNA污染，电泳图谱与21 kb位置相齐。
3 讨论
由于小球藻具有很厚的细胞壁[11]，并且是单细胞真核藻类，细胞直径3～8 μm，这些小球藻自身的特性给小球藻基因组DNA提取造成了不小困难，其细胞壁破碎和细胞溶解效果对基因组DNA的提取产率和效果具有较大影响；已有小球藻基因组DNA提取方法[12]，如任学艳等的SDS法[13]。
SDS法试验步骤较多，在研磨时由于没有缺少合适的保护试剂，DNA容易被降解，影响到基因组DNA的产率和提取速度。
CTAB法现在有较多的改进方法[13-14]，但是基因组得率较低，张桂和等提取的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）得率为695 μg/g
鲜质量[14]。
陈颖等的超声波法和纤维素酶法有RNA污染、DNA降解以及产率低的问题。
本试验采用加入Trizol后进行玻漓匀浆器研磨，一是保证小球藻的充分破碎，对小球藻基因组DNA起到保护作用，是保证基因组DNA的得率的重要因素。
本试验设计出了提取普通小球藻基因组DNA的方法；该方法稳定可靠，并且具有简单快速获取高纯度和高产率基因组DNA的优点。
该方法可以被用于分子生物学试验作为常规提取普通小球藻基因组DNA的方法。
参考文献：
[1]Chomczynski P，Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction[J]. Analytical Biochemistry，1987，162（1）：156-159.
[2]秦娟娟，路志勇，焦章平，等. 改良TRIzol法同步提取血液RNA和DNA[J]. 法医学杂志，2013，29（3）：209-211.
[3]Daniell H，Chebolu S，Kumar S，et al. Chloroplast-derived vaccine antigens and other therapeutic proteins[J]. Vaccine，2005，23（15）：1779-1783.
[4]邹宁. 生物反应器培养藻类生产生物柴油技术[C]// 2008农业生物环境与能源工程国际论坛论文集. 北京：中国农业工程学会，2008：130-133.
[5]赵引德. 新奥微藻制生物柴油中试成功[N]. 中国化工报，2008-12-12（2）.
[6]Hayashi K H，Hayashi T. A screening strategy for selection of anti-HSV-1 and anti-HIV extracts from algae[M]. Chichester，UK：John Wiley&Sons Ltd，2009：264-271.
[7]江红霞，郑怡. 8种微藻抗菌活性研究[J]. 福建师范大学学报：自然科学版，2002，18（2）：117-120.
[8]浩云涛. 椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea）的污水净化效应及其对Cd2+的耐受性机制
[D]. 南京：南京师范大学，2002.
[9]王暑辉，徐倩，徐筱，等. 富含多糖多酚的侧柏叶片总RNA提取方法[J]. 吉林农业大学学报，2012，34（1）：76-80，89.
[10]李士虎，朱明. 分光光度法测定单胞藻数量初步研究[J]. 淮海工学院学报：自然科学版，2001，10（增刊1）：8-9.
[11]Hiroshi T，Tayoyasu H. Studies on the cell wall of Chlorella Ⅲ：Incorporation of photosythetically fixed carbon into cell wall of synchronously growing cells of Chlorella ellipsoidea[J]. Plant & Cell Physiology，1982，23（6）：1033-1040.
[12]陈颖，刘根齐，李文彬，等. 3种小球藻DNA提取方法的比较[J]. 植物生理学通讯，2001，37（3）：242-244.
[13]王恒强，孔庆军，任雪艳，等. 小球藻的分离及其DNA提取方法的研究[J]. 农业科学与技术：英文版，2008，9（4）：44-46.
[14]张桂和，徐碧玉，王珺. 几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测[J]. 热带海洋学报，2007，26（1）：68-72.。