AKTAPrimer层析系统在天然产物分离中实验
AKTA 层析分离技术PROTEINPPT课件
Ni2+
15
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
3:
洗脱GST 融合蛋白
kD
94 67 43 30 20.1 14.4
12 3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化
系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品) 立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
6
GST MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
GSTrap™ 1 ml
10 - 12 mg
GSTrap 5 ml
50 - 60 mg
Glutathione Sepharose™ 4B 8 mg / ml
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
10 -12 mg / ml
注意
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
13
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒
最新AKTA蛋白纯化系统操作(干货分享)
AＫＴA蛋白纯化系统操作ＡKＴA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。
AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLＯREＲ、AKTA PＩLＯT、AKTA PＵRIFIER等多种型号的设备.以下以AKTA ＥＸPLORER为例简单介绍AＫTＡ蛋白纯化系统的一般操作。
1、认识AＫTA.AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。
该色谱系统的分离装置有三个主要组件,在底部平台的左侧整齐堆起(Fig １).它们是:FIG 1、ＡＫTＡＥXＰLORＥR主机•Pump—900 为双通道高效梯度泵系列.在AKTAexpｌorer １00,流速范围０.0１-1０0 mｌ/ｍin,压力高达１0 Mpａ（泵名为Ｐ-901).在AＫTA eｘplｏre10，流速范围0。
０0１-10 ml/min，压力高达２5 Mpa（泵名为P—903)。
• Moｎitor ＵＶ—900，同时监控１90－70０ nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外—可见（UV-Vis）监测器。
（针对部分ＡＫTＡPURＩＦＩER机型,尚有UPＣ-900监测器可供选择,光源为汞灯光源,一次可以监控一个波长，安装滤光片后,可以在选择的波长范围内进行切换。
)• Ｍoniｔor pH/C－９00,在线电导和pH 监测的组合监测器。
Ｆｉｇ２、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTＡEXＰLＯREＲ系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig ２)。
组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。
打开装阀的门可全部看到。
柱被挂在装阀的门的外侧。
分离装置由ＵNIＣORN 软件控制。
软件安装于一独立的电脑主机之中,在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU9５０进行控制。
２、一般操作2。
1 开机按位于底部平台前左侧的ＯＮ／OＦF 按钮，打开色谱系统,然后打开电脑电源。
待仪器自检完毕(CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁)。
AKTApilot
图 6. UV 流动池。
压力和空气传感器 系统有四个压力传感器测定压力。有两个传感器恰好位于柱 前和柱后，可以读出经过柱的压力差异。另外两个压力传感 器位于泵后，以保证在高压下流速快速停止时的安全。在系 统中有两个不同的空气传感器，一个用于加样，另一个用于 柱的保护。 空气传感器使用超声技术检测流经液体中的空气， 与在 AKTA 和 BioProcessTM 系统中使用的空气传感器有相同功 能。
图 8. 用 SOURCE 30 Q 进行精细纯化的 AKTApilot 和 AKTAexplorer 100 的层析图谱。
.5.
AKTApilot
可靠的灭菌
AKTApilot 的灭菌效率经受了灭菌程序的测试，该法用 1 M 氢 氧化钠 (NaOH) 作为杀菌剂进行微生物攻击实验。 系统用包括 由美国药典 United States Pharmacopoeia (USP 25) 推荐的三 个细菌系和一种通常用于生产环境的酵母菌系的溶液感染系 统 (表 1)。USP 25 要求菌落形成单位呈 log 6 减少。
AKTApilot — 系统规格
系统流速 非梯度和梯度 双模式 操作压力 表 1. 攻击的微生物 UV 波长范围
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FDA 21 CFR Part 11
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AKTApure层析系统
肽的纯化中 • 客户定制的系统可随着您的研究需要的发展轻松的升级 • 系统设计理念来源于公认的 ÄKTA avant，可靠性值得信赖 • UNICORN 6 软件提供简单、直观和灵活的预编程方法模板
和系统控制，可简化您的工作 • 可用于所有 GE Healthcare 实验室规模层析柱
图 1. ÄKTA pure 是一种用于蛋白质、肽和核酸在实验室规模的可靠纯化的 灵活层析系统。
用于层析柱夹和设备连接的多轨道位于仪器的前部和一侧。 仪器顶部的缓冲液托盘提供容器和收集瓶的存放区域。仪 器的控制面板显示系统的状态，并且可以通过触摸按钮进 行运行操作（暂停 / 继续）。
基 本 配 置 的 系 统 仅 重 48 kg， 选 择 所 有 选 配 组 件 时 重 53 kg。相对低的重量使它能够更简单地被放置在实验台上， 系统尺寸使它可以更方便地安装在标准的层析冷柜中，用 于不稳定样品的纯化。
29-0211-96 AA 1
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5
150
A280 nm
A214 nm
125
A340 nm 23
5000 4000
以便使方法继续到下一步而气泡不会进入流路或层析柱。
A280 nm and A340 nm (mAU) A214 nm (mAU)
AKTA层析系统
UNICORN软件的安装向导功能可对流路进行自动安装和功能性检测。自动安装向导可以确保 UNICORN已经通过第三方机构的独立审记，根据FDA 21 CFR Part 11以及cGMP要求生产设
结果的可重复性和放大操作
ÄKTAready系统可进行工艺放大和小规模生产。用户可在实验室规模下进行工艺参数的确定 用于ReadyToProcess层析柱的介质也有单独包装的层析介质供选择。通过Pre药品生产企业在设备投入生产应用前得到法规资格认证。ÄKTAready层析系统
图2.（a）ÄKTAready流路配置。（b）ÄKTAready系统上空气陷阱的位置（c）温度探头，电
• 产品文档 - 提供接触料液管路的详细材质信息，并具有完整的可溯源性，包括USP VI认证以 • ÄKTAready流路法规支持文件（RSF）- 提供生产工艺以及可析出化合物的安全评价报告。 • 验证文件 – ÄKTAready系统中集成了流路的一整套功能测试操作方案。每个流路组件中同时 • FastTrak Validation™ - 提供各种完备的文档资料和现场认证等专家服务。
AKTA全自动层析仪(AKTA Purifier)操作规程
AKTA全自动层析仪（AKTA Purifier）操作规程1.开机打开主机和电脑电源，待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮不闪烁），双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。
2.准备流动相和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45 um的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。
当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈，甲醇），需在使用前用低频超声唾弃10 min。
3.清洗管道及装柱3.1首先将A1管道放入平衡液或banding buffer中，将B1管道放入高盐溶液中或elutionbuffer中，再system control窗口点击manual → pump → pump wash basic，选中A1，B1管道为ON，点击execute。
泵清洗程序会自动运行至结束。
3.2选择manual → pump → flow rate，输入流速为1 mL/min，点击insert；选择manual →alarm＆mon → alarm pressure，设置high alarm（输入填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），点击insert，点击execute。
将进样阀的1号位管道接入柱子的柱头（用几滴管道中流出的液体润湿，防止空气进入），稍微拧紧后将柱子下端的堵头卸掉，直接拧入紫外流动池或连接管道（可用柱子中流出的液体润湿接头，防止空气进入）。
4.手动运行4.1平衡柱子平衡好了（观察电导COND及pH的数值曲线走稳了），此时将紫外调零：选择manual → alarm＆mon → autozero，点击execute，就准备上样了。
4.2上样4.2.1用样品环上样：将样品吸进注射器，推掉气泡，从进样阀的3号位推入（进样量不得低于样品环的体积的2倍），不要取下注射器，选择manual →flowpath → injectionValve → inject，点击execute。
4.2.2用样品泵上样（AKTA explorer系统）：将样品置于Sample Valve 1号位（可以选8个不同的位置），点击manual → pump → Direct Load_960输入进样流速和体积，点击execute。
AKTABasic
18-1111-26 18-1108-40 18-1108-41 18-6083-01 18-1116-61 18-6083-00
订购信息
AKTA BASIC pH/C 除了完全兼容各个厂家所生产的 HPLC 和 FPLC 的预装柱如 Mono Q 和 Mono S 高效柱外，并且可使用 全新设计的高效快速 Tricorn 预装柱。这些预装柱完全采用惰性塑料（polyetheretherketone），化学稳定性和分辨率更高，加 上最新推出的一系列rap 小柱，总共超过 180 根预装柱的资料在 UNICORN 里面收藏， 全面包含了凝胶过滤、离子交换、疏水、亲和和反相层析等纯化蛋白的各种层析技术，定能帮助您更有效地解决纯化中的 难题。
的重复性，而且在每次系统启动时都会自动进行自检和校 正，从而保证了仪器的高度精确和每次运行的重复性。图2、 图3显示了重复注射同一样品时此系统多次运行的层析结果。
—— AKTA BASIC pH/C 层析系统。本系统的配置使流速准
确且范围宽广，190 nm-700 nm 的三波长在线检测使层析过
程一目了然，电导的在线检测也使工艺放大变得简单易行。
广泛的适用范围
★ 安玛西亚所有层析产品都使用UNICORN控制软件， UNICORN控制软件可实现从实验室到工业生产的全程 控制和数据处理。
★ 每分钟100毫升的流速 (AKTATM BASIC pH/C100) 不 仅可以满足实验室研发阶段的需求，也可以满足中试阶 段的需求。
★ 耐受25MPa的压力 (AKTATM BASIC pH/C10) 不仅可 以进行中低压的分离纯化，也可以满足高压的反相层析。
Hitrap Chelating 5 × 1ml (50 mg µMCu2+) Hitrap IgM purification 5 × 1 ml
akta操作注意事项
AKTA蛋白纯化层析系统操作规程
1、使用前，根据自己所要分离蛋白的性质确定所需的分离柱及缓冲液，打开计算机及仪器，但不要急于打开软件，等计算机与仪器连接再打开软件，此过程大约需要3-5分钟。
2、将纯水先抽滤脱气（使用≤0.45μm的滤膜），然后选择流路连到机器上，先洗泵，然后给机器一个流速和压力。
选择的最高压力须小于柱子所能承受的压力极限。
3、将柱子连接到仪器上，接柱子时，须等进液管中的液体出来，将柱子的一头与进液管通过接头连接，先不要拧的太紧，等液体从柱子的另一头流出，再用接头将其与出液管相连拧紧，再将进液管端拧紧，这样防止柱子中进入气泡，影响分离效果。
4、柱子接上后，换上配好的缓冲液（须抽滤脱气）用缓冲液平衡至仪器的各条基线都平后，再上样。
5、上样时，必须通过滤膜过滤（0.22μm），具体上样体积视样品浓度而定，采用不同的上样环上样。
6、仪器使用完毕，切记要用纯水清洗泵和柱子，洗柱直至各条基线都平为止，防止盐和粒子结晶于泵和柱子使机器报废。
若长期不用，再用20%的乙醇清洗系统和柱子,防止泵和柱子生长微生物（这一步非常重要）。
7、仪器的PH计每隔一段时间（一个月）须校准一次。
紫外流动池也需定期清洗（三个月）。
生物技术中心仪器管理人：李红兵
2006年10月15日。