NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探.doc
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)
2.回收
回收（碱裂解法提取质粒DNA)
6．重组质粒克隆的鉴定
1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
8.浓度测定仪及琼脂糖凝胶检测
重组质粒的构建.
重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3基因提取—1、2、3PCR反应扩增目的基因—4、3PCR反应扩增目的基因—4、3DNA片段回收—5、3DNA片段回收—5、3重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5测序测序重组质粒提取—2、 3重组质粒提取—2、 3菌种保藏—7菌种保藏—7目的片段与载体连接及转化—6目的片段与载体连接及转化—6实验操作1、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract） 0.5gNaCl 1g琼脂（Agar） 1.5g单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
重组质粒的构建经验~~~
重组质粒的构建经验~~~第一篇：重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)载体酶切的问题 3)连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR 引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
质粒重组实验报告
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
重组质粒构建
P1及YAC载体
酵母人工染色体，可容纳外源基因片 段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色 体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1 ，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3 、TRP1和SUP4，能在酵母中稳primary） 工具酶：限制性内切酶
连接酶
常见的基因工程载体
载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起 复制与表达的运载工具。
❖ 根据来源：plasmid; phage; viral; BAC; YAC
❖ 根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核 生物表达载体
噬菌体载体
❖ λ噬菌体(λphage)
外源DNA：9~23kb 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系
列
❖ 粘性质粒(cosmid)： λDNA的 cos区+质 粒，双链环状DNA，克隆容量： 40~50kb
❖ M13噬菌体
λ噬菌体(λphage)
特点：一种能感染大肠杆菌的病毒， 野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb, 分子两端各有一个12bp组成的粘性末端, 感 染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补 连接成环, 连接处称COS位点。
例：
干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取 0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗 传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体 做法是：
从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之 与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而 用酵母菌来产生干扰素。
❖ 通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责 编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生 存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿 主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗 生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌 素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。
重组质粒的构建
重组质粒的构建[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
[仪器、材料与试剂]恒温摇床、紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T 4DNA连接酶缓冲液、载体、目的DNA片段[实验步骤]1、在微型离心管中混合以下试剂：试剂体积（uL）目的DNA 4载体分子1T4DNA连接酶及缓冲液52、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验。
构建重组质粒基本方法解析
构建重组质粒基本方法1. cDNA编码区片段的PCR扩增50ul 区模版15引物13引物1dNTP 110 ^buffer 5Taq 1Milliq H2O 402. PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75ml PE, 14Krpm,离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中8、往Spin柱的膜中央加入50卩l的EB（或milliq H 2O,静置2min, 14Krpm，离心1min3. 双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul , 37E，酶切n小时）：PCR产物20ul载体10ul10x buffer 3ul10x buffer 3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ul MilliQ H2O 4.7ul4 •双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1. 割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100卩l的体积）2. 50C，恒温10min,等到胶完全被溶解3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4. 加样液，14Krpm，离心1min5. 弃去排出液6. 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9. 往Spin柱的膜中央加入50卩l的EB（或milliq H 2O,静置2min, 14Krpm，离心1min5. 连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16C连接过夜。
连接体系如下：载体2ulPCR片段6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6.转化取上述连接液5卩l转化到预先制备的DH a化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42C 热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37C摇床45min,离心5000rpm, 1-5min （不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul ）。
重组质粒的构建
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定崔文强201300140012同组者：陈斌，郝书平【摘要】重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
这就需要正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
然后利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子。
接着将外源重组DNA引入受体细胞，所以首先要用CaCl2法制备感受态细胞，通过复制和表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状，再用红白斑筛选重组子，最后检验导入片段的大小。
本次实验涉及的操作方法有很多，比如利用CaCl2制备感受态细胞的方法、热击法转化E.coli的方法、重组DNA分子鉴定的基本方法、用试剂盒提取重组质粒DNA的方法和琼脂糖凝胶电泳的方法等等。
【关键词】重组质粒；限制性内切酶；DNA连接酶；感受态细胞；红白斑筛选；琼脂糖凝胶电泳【引文】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳检验的方法进行重组子的鉴定。
本实验采用单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。
选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。
重组质粒实验报告(DOC)
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现 DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组 DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。
学习利用 T4DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外 DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用 Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。
掌握α 互补筛选法和PCR 检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的 DNA 片段的大小。
学习和掌握 PCR 反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源 DNA 与载体分子的连接即为DNA 重组技术，这样重新组合的DNA 分子叫做重组子。
重组的 DNA 分子式在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+ 、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA 分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α 互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及 PCR 检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的 DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其纯化的开题报告
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表
达及其纯化的开题报告
一、选题依据：
随着生物技术的发展，越来越多的融合蛋白被构建和应用于生物医学和工业生产领域。
Exendin-4Tβ4融合蛋白具有治疗糖尿病和愈合创伤的潜力，因此对其构建、表达和纯化进行研究具有重要意义。
二、研究内容：
本研究的主要内容包括：
1.设计Exendin-4Tβ4融合蛋白的基因序列，构建原核表达载体。
2.将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌中，进行表达。
3.对表达产物进行纯化的优化研究，找到最优的纯化条件。
4.对获得的纯化产物进行生化特性分析，包括分子量、活性和稳定性等方面的研究。
三、研究意义：
Exendin-4Tβ4融合蛋白是一种具有很高应用价值的重组蛋白，可在治疗糖尿病和促进创伤愈合等方面发挥作用。
本研究的结果将为其在生物医学和工业生产方面应用提供支持和参考。
四、研究方法：
1.基因合成和克隆：根据序列设计构建Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒。
2.转化及表达：将重组质粒转化到大肠杆菌，并通过诱导表达目标蛋白。
3.蛋白纯化：采用不同的纯化方法对重组蛋白进行分离纯化，并对
纯化后的样品进行鉴定和分析。
4.蛋白质特性分析：对获得的重组蛋白进行生物学特性、生化学特性、结构特性等方面的分析。
五、预期结果：
本研究预期利用原核表达系统构建出 Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒，并通过表达和纯化得到纯度高、活性强、稳定性好的重组蛋白。
同时，对其生化特性进行了深入研究，为其应用提供了实验数据和支持。
NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探
NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探赵丽君刘燕翔刘珍王伯瑶黄宁吴琦【摘要】目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。
方式：以细胞基因组DNA为模板作，采纳PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。
将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观看报告基因表达水平。
结果：酶切及测序证明NOX4报告基因质粒构建成功。
转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。
结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。
【关键词】 NOX4;报告基因;表达调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶第一发觉于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸暴发，产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，成为机体抗击微生物感染的重要成份[1]。
最近几年，在非吞噬细胞质膜上发觉了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPH oxidase)蛋白家族。
人类基因组同源性检索发觉了7种NADPH氧化酶，即NOX一、NOX二、NOX3、NOX4、NOX五、Duox1和Duox2[2-4]。
NOX家族普遍表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。
为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反映中的作用，咱们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3NOX4，并初步观看了炎症细胞因子对该基因表达水平的阻碍。
1 要紧材料和试剂A549上皮细胞株、 DH5α为本实验室保留。
荧光素酶报告基因载体pGL3basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRL TK及Dual Luciferase Report Assay System为Promega产品。
实验四.重组质粒载体的构建
六、实验步骤
1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的 限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水 使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶 液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心 机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个 实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制 性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免 活性降低。
四、实验仪器设备
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速 离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支 架, 照相机及其附件。
五、实验试剂 1、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉 蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 2、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制 成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器, 储于 室温即可。
2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适 当的支持物上（如插在泡沫塑料板 上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应 完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注意事项
1. 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成 分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应 条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多 实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用 量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中 的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶 反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油 中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶 活性将受影响。
重组exendin-4的克隆、表达与纯化的开题报告
重组exendin-4的克隆、表达与纯化的开题报告标题：重组exendin-4的克隆、表达与纯化摘要：Exendin-4是一种来自于蜥蜴的GLP-1类似物，已经被广泛应用于糖尿病和肥胖症的治疗研究中。
重组exendin-4的产生需要进行基因克隆、表达和纯化。
本文总结了国内外关于克隆、表达和纯化exendin-4的研究进展，并介绍了本实验室开展该工作的技术路线和实验方案。
关键词：Exendin-4，基因克隆，表达，纯化1. 背景Exendin-4是一种GLP-1类似物，以其具有与人GLP-1相似的抗糖尿病和抗肥胖症的治疗效果而备受研究者的关注。
目前，Exendin-4的应用主要是通过对天然Exendin-4的化学合成和改良达到的，但这种方法存在成本高和效率低的问题。
因此，基于重组DNA技术生产Exendin-4，将成为一种更加经济且可持续的制备方法。
2. 克隆、表达和纯化Exendin-4的研究进展早在2003年，李强等人就利用PCR方法扩增了人GLP-1与蜥蜴Exendin-4的前体基因，经过转染到CHO细胞中表达并使用质谱分析证实了其产物为Exendin-4。
自此，越来越多的研究者开始利用重组DNA技术克隆、表达和纯化Exendin-4，并进行进一步的研究开发。
克隆方面，主要采用了PCR扩增和多克隆位点组装技术，通过对反应体系和反应条件的不断优化，提高了克隆的效率和准确率。
表达方面，采用了多种不同的表达载体和宿主细胞，以获得更高的表达水平和产量。
同时，通过优化工艺，如在发酵过程中对培养基的调节和添加适量的缓冲剂用于抑制蛋白质附着，也能够进一步提高Exendin-4的表达水平。
纯化方面，常采用流动相色谱技术，如高效液相色谱、反相纤维素色谱、亲和层析和离子交换层析等方法。
3. 实验方案本实验室计划采用PCR扩增和多克隆位点组装技术来克隆Exendin-4的前体基因，构建重组表达载体并转染到大肠杆菌中表达Exendin-4。
24 生物化学实验--重组质粒的构建
重组质粒的构建【目的】1. 验证基因工程的基本理论和聚合酶联链反应的基本原理。
2. 熟悉重组质粒的构建和利用聚合酶联链反应法获取目的基因的方法。
3. 了解 PCR 仪的使用方法。
【原理】1.DNA 的分离与纯化原理基因组 DNA 因来源不同、性质不同以及用途不同，其分离纯化的方法也不相同。
哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离与纯化的方法主要有酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法以及各种快速方案。
本实验以哺乳动物细胞为例，介绍制备高分子量DNA 样品的酚抽提法。
酚抽提法可用于多种来源标本的高分子量 DNA 样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜的组织以及血液标本等。
本实验所用的酚抽提法源自对 1976 年 Stafford 及其同事提出的方案的改进。
它以含 EDTA 、 SDS 及 RNA 酶（无 DNA 酶）的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶 K 处理后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而 DNA 进入水相，重复抽提 DNA 至一定纯度，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需范围的高分子量 DNA 样品。
分离过程中 EDTA 为二价金属离子螯合剂，可以抑制 DNA 酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。
SDS 为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质 ,SDS 与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀 ,SDS 的非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性和降解，所以 SDS 同时还有降解 DNA 酶的作用。
无 DNA 酶的 RNA 酶可以有效水解 RNA ，而避免 DNA 的消化。
蛋白酶 K 则有水解蛋白质的作用，可以消化 DNA 酶和 DNA 上的蛋白质，也有裂解细胞的作用。
酚可以使蛋白质变性沉淀，也可抑制 DNA 酶的活性。
pH8.0 的Tris 缓冲液能保证抽提后 DNA 进入水相，而避免滞留于蛋白质层。
多次抽提，可提高 DNA 的纯度。
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NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探作者赵丽君刘燕翔刘珍王伯瑶黄宁吴琦【摘要】目的构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。
方法以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列533bp，插入质粒载体，构建重组质粒，重组质粒经酶切和测序鉴定。
将转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。
结果酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。
转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。
结论成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。
【关键词】NOX4;报告基因;表达调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧簇reactive oxygen species,ROS，成为机体抵抗微生物感染的重要成分[1]。
近年，在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOXNADPH oxidase蛋白家族。
人类基因组同源性检索发现了7种NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[2-4]。
NOX家族广泛表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。
为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用，我们构建NOX4报告基因重组质粒OX4，并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。
1 主要材料和试剂A549上皮细胞株、E.coli DH5α为本实验室保存。
荧光素酶报告基因载体，海肾荧光素酶内对照报告载体及System为Promega产品。
质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega 公司。
DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。
新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子、购自PeproTech公司。
Pfu酶，dNTP,限制性内切酶Xho1，BamHⅠ，T4DNA连接酶等购自Takara公司。
基因组DNA提取试剂盒，DL2000 DNA Marker购自天根生物技术有限公司。
2 方法 2.1 质粒载体的构建 2.1.1 引物合成通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有结合位点的NOX4基因上游调控序列。
引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下P1CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAGP2GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA 引物分别含限制性内切酶Xho1，BamHⅠ酶切位点，扩增片段全长533bp。
引物由大连宝生物技术有限公司合成。
2.1.2 PCR 以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。
反应体系为25μL，含10PCR反应buffer2.5μL; dNTP 2μL;上下游引物各0.5μL;P fu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水补足。
反应条件为94℃变性3min，之后进行30个循环94℃30s，.51℃30s，72℃4min,，，72℃延伸10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。
载体用Xho1，BamHⅠ双酶切，小牛肠碱性磷酸酶CIAP去磷酸化，1琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。
2.1.3 重组质粒的构建经酶切纯化后的PCR产物和载体用T4DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α感受态细菌中，涂布于LB培养板，37℃孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamHⅠ进行双酶切鉴定，最后经ABI 3730全自动DNA测序仪进行测序上海英俊生物技术有限公司。
2.2 细胞转染及报告基因活性检测 2.2.1 细胞转染用含10新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。
将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95时，按照Lipofectamine 2000说明书进行重组质粒和载体转染。
具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM 100μL/孔，Lipofectamine 2000与质粒DNA报告基因重组质粒和内对照质粒以一定比例各加入100μL无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，再加入细胞培养孔，37℃，5CO2的孵箱中培养24-48h。
2.2.2 细胞因子刺激试验实验分组为组，组，组，空白对照组。
终浓度为25ng·mL-1，终浓度为10ng·mL-1，在细胞因子刺激A549细胞的不同时间点6h，12h，24h，裂解细胞检测NOX4报告基因表达水平。
实验均设3复孔。
2.2.3 报告基因活性检测在细胞因子刺激细胞后的不时间点吸去培养基，PBS洗涤细胞。
每孔加入60μL的1PLB细胞裂解液按Report Assay System试剂盒说明配备，孵育30min，收集裂解液，10000转4℃离心10min，上请储存于-20℃备用。
取20μL细胞裂解上请，根据Assay System试剂盒说明进行报告基因萤火虫荧光素酶及内对照海肾荧光素酶检测，仪器采用Beckman Coulter DTX880。
实验数据采用SPSS软件进行分析，采用T检验。
3 结果 3.1 报告基因重组质粒的构建和鉴定以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。
产物于1的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果在约533bp处可以见到与预期大小相符的目的片段图1。
PCR产物插入载体，得到重组质粒经XhoⅠ，BamHⅠ双酶切鉴定，显示有一条为约533bp片段图2，通过上海英俊生物公司测序证实，重组质粒目的片段与Genbank报道序列一致。
3.2 细胞因子刺激A549细胞报告基因活性检测用细胞因子，刺激转染了报告基因的A549细胞，分别于刺激6、12、24小时裂解细胞测定荧光素酶活性。
结果显示单独采用或都能够刺激报告基因的表达，而联合使用两种细胞因子的刺激作用更强。
在刺激6、12、24小时，两种细胞因子刺激实验组荧光素酶活性分别为未加细胞因子的阴性对照组DMEM对照荧光素酶活性的2.6、2.2、2.0倍。
实验数值经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，P0.05图3 4 讨论表达于中性粒细胞和单核/巨噬细胞的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶最先被发现，该酶是吞噬细胞呼吸爆发的关键分子，吞噬细胞通过呼吸爆发产生大量活性氧ROS，成为依赖氧杀菌机制的重要介质[1]。
吞噬细胞NADPH氧化酶的催化亚基gp91 phox位于细胞质膜，当细胞受刺激后，与胞浆中其他亚基p22phox，p47phox，p40phox，p67phox,和Rac共同形成有活性的NADPH氧化酶复合体。
吞噬细胞gp91 phox现在称为NOX2。
与gp91 phox结构同源的分子共同组成NOX蛋白家族，他们包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5，Duox1和Duox2。
他们与NOX2一样均参与细胞ROS生成，所不同的是，NOX2似特异表达于吞噬细胞，而NOX蛋白家族其他成员在组织细胞有广泛表达，由于他们发现较晚，其生理功能研究有待深入[2-3]。
活性氧往往作为第二信使参与细胞信号转导，在MAPKs 信号通路、信号通路、信号通路等，都有活性氧参与其中，这些信号传导与细胞分裂分化，转化，迁移，凋亡等过程密切相关，由此也提示NOX蛋白家族与上述重要生命现象关联[4-6]。
最初研究表明，NOX4在肾脏组织中大量的表达，它可能作为一种敏感性氧感受器，NOX4主要分布在鼠肾的近端小管和人肾单位远端，而促红细胞生成素EPO的生成与管周细胞相邻。
在肝脏也表达少量NOX4的mRNA，提示N0X4可能作为EPO合成的氧感受器[7-8]。
最近有研究发现，NOX4在中枢神经系统的神经元中也有一定表达。
除了NOX2，NOX家族其他分子在机体天然免疫及炎症中的作用仍有待研究[9-10]。
本实验构建了NOX4荧光素酶报告基因重组质粒，成功转染A549细胞，以此为模型，观察炎症细胞因子对NOX4表达的影响，结果发现、刺激NOX4基因表达，这不但提示NOX4参与细胞炎症反应，同时为我们进一步探讨NOX家族在机体对抗微生物感染过程中的作用奠定了很好的基础。
【参考文献】 1 Clark RA. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidase[J]. J Infect Dis, 1999, 179Suppl 2 S309-S317. 2Kikuchi H, Hikage M, Miyashita H, et a1. NADPH oxidase subunit, gp91phox homologue, preferentially expressed in human colon epithelial cells[J]. Gene, 2000, 2541，2 237-243. 3Cheng GJ, Cao ZH, Xu XX, et a1.Homologs of gp91phox cloning and tissue expression of NOX3, NOX4, and NOX5[J]. Gene, 2001, 2691131-140. 4Clempus RE, Griendling KK. Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cells[J]. Cardiovasc Res, 2006, 711 216-225.terminal kinase through p47Phox [J]. Exp Cell Res, 2002, 2721 62-74. 6Madamanchi NR, Li S, Patterson C, et al. ReactiveJAK/STAT pathway[J]. Arterioscler ThrombVasc Biol, 2001, 212 321-326. 7GeisztM, Kopp J B, Vamal P, et a1.Identification of Renox, an NADPH oxidase in kidney[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97158010-8014. 8Shiose A,NADPH oxidase in kidney[J]. J Biol Chem, 200l,27621417-l423. 9Geiszt M, Leto TL. The Nox family of NADPH oxidases host defense and beyond[J]. J Biol Chem, 2004, 27924 51715-51718. 10Lambeth JD. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen[J]. Nat Rev Immunol, 2004; 41181-189.。