基因重组方法=全

Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F′因子。
F′×F-与F+×F-的不同：给体的
部分染色体基因随F′一起转入受体细胞
a）与染色体发生重组；
b）继续存在于F′因子上， 形成一种部分二倍体；
3.1.2 细菌的转导（transduction）
缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、
包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。
但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过 DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。
局限性转导与普遍性转导的主要区别：
a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的
1) 意外的发现
的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：
1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外
用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞
不接触的情况下，同样出现原养型细菌！
沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌
3.1 原核生物的基因重组
细菌的三种水平基因转移形式
接合
转导 自然转化
接合 (conjugation)： 细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导(transduction)：
由 genetic transformation)：
游离DNA分子 + 感受态细胞
证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）
(2) 机制
(大肠杆菌的接合机制)
接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导
F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛 （sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。
含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛
可能全部是宿主菌的基因。
b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。
溶源转变（lysogenic conversion）：
一个与转导相似又不同的现象 温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因 整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。
特点：在选择培养基平板上形成微小菌落
转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。
流产转导（abortive transduction） 进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子
外源DNA被降解，转导失败。
(2)局限性转导（specialized transduction）
摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
(1)自然遗传转化（简称自然转化）
1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象
目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同， 利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8
普遍性转导的基本要求：
形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须 具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解 以前进行包装。
DNA 不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA， 普遍性转导的三种后果： 而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因 子。 细胞表面同样有性菌毛。
1） F+×F-杂交
F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。
杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞
理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株
温和噬菌体感染
整合到细菌染色体的特定位点上
宿主细胞发生溶源化
溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上 部分缺陷的温和噬菌体
把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中
温和噬菌体λ裂解时的
不正常切割：包含gal或bio基因
（几率一般仅有10-6）
建立了感受态的受体细胞 外源游离DNA分子
枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）
分泌感受态因子 与细胞表面受 体M相互作用
使细胞表面的 DNA结合蛋白及 核酸酶裸露出来 ，使其具有与 DNA结合的活性
诱导特异蛋白质如自溶素表达
双链DNA与感受态细胞表面的特定位 点吸附，DNA的一条单链被降解，另 一条单链进入受体细胞，并与受体 细胞染色体DNA的同源部分配对，接 着受体染色体上相应单链片段被切 除，并被外来的单链DNA交换、整合 和取代，形成杂种DNA，
Hfr 菌株仍然保持着 F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F2） Hfr ×F-杂交 细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生 Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移 缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体 DNA向受体细 过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F 细胞并发生重组 胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末 ，由此而得名为 。 端，由于转移过程常被中断，因此 F因子不易转入受体细胞中，故 Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。
LA-22端出现了原养型 的个体（his+,try+）
溶源性菌株LA-22 中少数细胞在培养 过程中自发释放出温和型噬菌体P22
通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2 LA-2裂解后，产生大量的“可滤过因子 ”，其中极少数在成熟过程中包裹了 LA-2的DNA片段(含try+基因)
通过滤板再度感染LA-22
3.1.1细菌的接合作用(conjugation) （参见 P 215）
通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程
(1).
1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm
细菌的多重营养缺陷型杂交实验
中间平板上长出的原养型菌落 是两菌株之间发生了遗传交换 和重组所致！
b）决定因素也各有不同；
(2)人工转化
在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。 不是由细菌自身的基因所控制； 用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。 用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
质粒的转化效率高；
3、基因重组
基因重组（gene recombination）是两个独立基因组内 的遗传基因，通过交换与重新组合形成新的稳定基因组 的过程。
原核微生物基因组 通常只是部分遗传物质的转移和重
组，并且通过转化、接合和转导等形式进行；
真核微生物的基因重组 发生在有性繁殖过程中，通过
减数分裂后整套染色体发生高频率交换（基因重组） 在真核微生物中的部分真菌存在不通过减数分裂而在有 丝分裂过程产生低频率基因重组的准性生殖方式
3.2 真核生物的基因重组
在自然环境中，真核微生物就存在有性生殖和准 性生殖等基因重组的形式。
酵母菌有性杂交 霉菌的准性杂交
3.2.1 酵母菌的有性杂交
酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍 体世代，又包括有性和无性世代。 减数分裂形成子囊孢子
二倍体
单倍体
每个子囊中含 有四个单倍体 的子囊孢子
酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较
溶源转变与转导的不同？
a）不携带任何供体菌的基因； b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；
3.1.3细菌的遗传转化（genetic transformation）
定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然
或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程
感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞
F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
F因子的四种细胞形式
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）
转导(transduction)：
由噬菌体介导 游离DNA分子 + 感受态细胞
自然遗传转化(natural genetic transformation)：
“接合” “转导” 及“自然转化”这三种在自然界 存在的细菌遗传重组过程各自的特点：
a）外源DNA的来源及进入途径有差异；
酿酒酵母
两种接合型α和a （单倍体）
融合
二倍体细胞(α/a)
酿酒酵母接合型是由自身的遗传特性决定的
受MAT活性区调控，由MAT启动子控制
α和a基因是不表达的沉默基因，只在发生接合型 （单倍体）转变时用作α或a基因插入的来源
（competent cell）
自然遗传转化（natural genetic transformation） 人工转化（artificial transformation）