基因重组技术论文

基因重组技术

学生姓名：赵慧芳学号：20115071261

生命科学学院生物科学专业

指导教师：张海滨职称：教授

摘要：基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。发生在生物体内基因的交换或重新组合。包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。是生物遗传变异的一种机制。基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。[1]

关键词：基因重组；特点；分离；纯化

Abstract: Genetic recombination is the result of the fracture and the connection of different DNA strand DNA fragments of exchange and recombination, the formation of new DNA molecule. In organisms of gene exchange or recombine. Including the homologous recombination, site specific restructuring, transfer function and abnormal four categories. Is a mechanism of biological genetic variation. Genetic recombination is refers to the recombination between alleles. Can produce a large number of variation types, but only to create new genotypes, does not produce new genes. Genetic recombination is the cytological basis of the original cells first division of meiosis, homologous chromosomes split each other, not the free combination between homologous chromosomes and the intersection of the chromatids of homologous chromosomes swap. Genetic recombination is the theoretical foundation of the cross breeding. Gene mutation is refers to the change of the molecular structure of the gene, the gene sequence of DNA nucleotides changed, resulting in the change of the genetic information.

Keywords: Genetic recombination；feature；separate；purification

1.基因工程的核心

目的基因和适当的载体在连接酶的作用下形成重组子，再转入相应的受体细胞进行繁殖，从而使外源基因得到表达。

通过分离、纯化、扩增等一系列实验步骤后获得目的基因，再根据欲使目的基因进行有效表达的受体细胞选择适当的载体，然后将目的基因与表达载体在体外进行有效连接。

重组DNA的步骤：连接，转化，筛选。

重组DNA的优点：简单易行方便后续操作，节点处加内切酶位点不破坏目的基因的阅读框

1.1黏性末端DNA分子间连接

如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。

缺点：外源DNA和载体都可环化，造成插入的外源DNA有两种相反连接方向。解决方法：去磷酸化，双酶切取代式。

两种相同的限制性内切酶分别剪切外源DNA，然后再连接，这那么，载体分子和外源DNA片断将按唯一的一种取向退火形成重组DNA分子。这就是所谓的定向克隆技术。这种技术能够克服插入式（单酶切）带来的缺点。

1.2平末端连接

T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA 连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。

1.3同聚物加尾法

酸转移酶要求底物DNA上必须带有凸出的3’-OH，所以，得先用5’-外切酶处理DNA底一个DNA3’末端加多聚A，一个DNA3’末端加多聚T。但是由于末端核苷物。其他几类还有人工接头连接和其他连接技术如T-载体连接。

2.基因转移

将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。

重组质粒DNA分子转化大肠杆菌的基本步骤：细菌感受态的形成→转化因子的吸收→整合复合物前体的形成→单链DNA转化因子的整合→转化子的形成。

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。

大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2