二仙汤对顺铂损伤后小鼠卵巢功能调节作用研究_艾浩

天津中医药Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2013年5月第30卷第5期May 2013,Vol．30No．5二仙汤对顺铂损伤后小鼠卵巢功能调节作用研究艾浩1，2，张海英3，张玉立4，薛晓鸥4（1.辽宁医学院附属第三医院妇产科，锦州121000；2.辽宁省卵泡发育与生殖健康重点实验室，锦州121000；3.辽宁医学院，锦州121000；4北京中医药大学东直门医院，北京100700）摘要：[目的]探讨二仙汤对顺铂（CDDP ）损伤后小鼠卵巢功能的调节作用。

［方法］采用化疗损伤性小鼠卵巢功能早衰模型，给予二仙汤周期灌胃，检测血清生殖激素水平、卵巢排卵计数、卵巢组织中丙二醛（MDA ）的含量及总抗氧化能力（T－AOC ），观察卵巢形态学变化。

［结果］与卵巢早衰模型组比较，二仙汤给药组血清卵泡刺激素（FSH ）和黄体生成素（LH ）降低，而雌二醇（E 2）和孕酮（P ）均升高；卵巢组织MDA 降低，T-AOC 升高，卵泡计数增加，卵泡闭锁减少，细胞间质增生减低，卵巢纤维化状况改善。

［结论］二仙汤可通过抑制氧化损伤作用，降低细胞外基质的形成，加速细胞外基质降解，从而改善卵泡和颗粒细胞功能状态，提升卵巢功能。

关键词：二仙汤；生殖激素；卵巢功能中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1６７２－１５１９（２０１３）０５-0298-03*基金项目：国家自然科学基金项目（81173443）；辽宁省科学技术计划（2009225010-47）；辽宁省“百千万人才工程”培养经费（2009921040）；辽宁省教育厅优秀人才扶持计划（高校杰出青年学者成长计划）项目（LJQ2011087）。

作者简介：艾浩（1974-），男，博士，副教授，主要从事妇产科临床和科研工作。

通讯作者：薛晓鸥，E-mail:xxo123@ 。

随着肿瘤发病率的明显增加，因化疗而导致卵巢功能低下和不孕的患者日渐增多，成为卵巢功能早衰（POF ）发病的一个重要原因，而中药对POF 的治疗效果日渐显现[1-2]。

二仙汤对围绝经期综合征的疗效为临床所公认，已被载入多部中医方剂学著作,并得到了国内外中医界的公认[3]。

本研究旨在探讨二仙汤对化疗损伤性POF 卵巢功能调节机制，为POF 卵巢功能损伤的临床研究提供实验基础。

1材料与方法1.1实验动物ICR 小鼠60只，雌性，体质量28~30g ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验期间饲喂在二级动物室，温度（25±1）℃。

将实验动物按体质量均衡和随机的原则分为两组：模型组和二仙汤组，每组各30只。

1.2实验用药物注射用顺铂（CDDP ），齐鲁制药有限公司，规格每支20mg ，批号0403039。

二仙汤由仙茅、仙灵脾、巴戟天、当归、黄柏、知母饮片，按照6∶6∶6∶6∶3∶2的比例，蒸馏水提取、浓缩，过滤除菌，制成含生药0.5g/mL 水煎剂，中药液体包装机包，4℃冰箱保存备用。

1.3实验用试剂卵泡刺激素（FSH ）、促黄体生成素（LH ）、雌二醇（E 2）和孕酮（P ）ELISA 试剂盒均购于美国Biosource 公司。

透明质酸酶试剂盒购于SIGAM 公司。

1.4实验方法参照文献[4]制备POF 动物模型；CDDP 给药剂量为2.0mg/kg ，连续腹腔注射7d 。

参照文献[5]二仙汤组以3.0g/kg 灌胃给药，每日1次，连续14d ，模型组灌服等量蒸馏水。

各组均于停药次日取材。

1.5小鼠一般状态观察注意生命体征、进食情况，每日测体质量1次。

1.6血清学指标检测采用摘眼球取血法，血液静置1h 后，3000r/min 离心20min ，分离血清。

严格按酶联反应吸附试验（ELISA ）试剂盒说明操作，药盒的批内变异和批间变异均<10%。

1.7小鼠排卵数测定取血后，每组各取5只小鼠左侧卵巢，在体视显微镜下针刺壶腹部挤出卵丘团，0.1%的透明质酸酶消散并洗去颗粒细胞，置体视显微镜下计数每只小鼠排出的卵子数。

1.8卵巢组织匀浆丙二醛（MDA ）、总抗氧化能力（T－AOC ）含量检测小鼠取血后，每组各取10只小鼠左侧卵巢组织于4℃条件下制备卵巢组织匀浆，检测各组小鼠卵巢组织中MDA 和T-AOC 的含量。

检测依照试剂盒说明书进行。

1.9卵巢组织石蜡切片HE 、Mallory 染色中性树DOI ：10.11656/j.issn.1672-1519.2013.05.152982013年5月第30卷第5期May2013,Vol．30No．5天津中医药Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine表2二仙汤对小鼠生殖激素调节作用结果（x±s）Tab.2The results of Er Xian decoction on reproductivehormones in mice分组n FSH（IU/L）LH（I U/L）E2（pmol/L）P（pmol/L）模型组301.85±0.67 3.92±1.21102.54±45.2810.63±3.72二仙汤组301.04±0.38*2.87±0.95*167.23±52.41**19.84±5.63**注：与模型组比较，＊P＜０．０５，＊＊P＜０．０１。

表3二仙汤对小鼠卵巢组织MDA、T-AOC结果（x±s）Tab.3The results of Er Xian decoction on MDA,T-AOC of ovary tissue and follicle number in mice（x±s）分组n MDA（nmol/mL）T-AOC（nmol/mL）模型组300.163±0.0210.392±0.073二仙汤组300.106±0.007**0.584±0.105**注：与模型组比较，＊＊P＜０．０１。

图1-1模型组HE染色（×40）：卵巢明显萎缩,皮质变薄，出现大量闭锁卵泡图1-2二仙汤组HE染色（×40）：卵巢闭锁卵泡减少,皮质增厚，可见次级卵泡图1-3模型组Mallory染色（×100）：蓝紫色染色面积增多，黄体少见图1-4二仙汤组Mallory染色（×100）：蓝紫色染色面积减少，黄体形成明显图1小鼠卵巢HE、Mallory染色结果Fig.1The results of HE and Mallory staining in mouseovarian胶封片，普通光镜观察、摄片。

1.10统计学方法采用SPSS18.0软件包统计分析，进行组间t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1对小鼠一般情况的改善作用二仙汤能增加小鼠进食量和体质量，明显改善小鼠生存状况。

结果见表1。

2.2对小鼠血清生殖激素水平的影响二仙汤明显升高小鼠生殖激素E2和P水平（P＜0．05），降低FSH和LH水平（P＜0．01）。

见表2。

2.3对小鼠卵巢MDA和T-AOC的影响二仙汤可对抗CDDP对卵巢的氧化损伤，使MDA明显降低（P＜0．01），T-AOC明显升高（P＜0．01）。

见表3。

2.4对小鼠卵泡发育的调节作用二仙汤可明显促进小鼠卵泡发育，减少卵泡闭锁，明显增加卵泡计数（P＜0．01）。

2.5对小鼠卵巢组织改善的作用模型组小鼠卵巢组织呈现“纤维化”样改变，肉眼观卵巢组织体积缩小，表面凸凹不平，镜下见皮质变薄，原始卵泡明显增多，典型的生长卵泡少见，偶见成熟卵泡；闭锁卵泡数量增加，并可见大量间质腺，且随用用药时间延长而明显增多。

Mallory蓝紫色染色细胞着色区域增加，染色加深。

二仙汤组小鼠卵巢组织中，成熟卵泡数量增加，闭锁卵泡数量明显减少。

Mallory蓝紫色染色细胞主要局限性集中于卵泡外膜细胞和间质细胞中，染色着色浅，与模型组比较差异显著。

见图1。

3讨论CDDP是临床上常用的治疗肿瘤的有效药物，但对生育期女性的生殖功能损害明显，甚至造成卵巢功能早衰。

二仙汤及其拆方有不同的延缓“下丘脑—腺垂体—卵巢”性腺轴调节轴（HPG）衰老的作用和增进该轴功能的双重药效[5]。

刘晴等[6]研究人员用放射免疫方法观察二仙汤及其拆方对原代培养雄性大鼠睾丸间质细胞分泌T、原代培养雌性大鼠表1小鼠给药后体质量检测结果（x±s）Tab.1The results of body weight of mice after medication（x±s）分组n小鼠体质量测量1d3d5d7d10d12d14d模型组3021.82±0.4221.65±0.5721.59±0.4922.03±0.6622.57±0.7223.24±0.6824.36±0.85二仙汤组3022.01±0.3821.98±0.4723.68±0.8724.51±0.7827.00±0.97*28.54±1.02*30.72±1.13*注：与模型组比较，*P<0.05。

ｇ299天津中医药Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2013年5月第30卷第5期May2013,Vol．30No．5黄体细胞分泌P及卵泡颗粒细胞分泌E2的影响。

结果显示，温肾拆方对雌性性腺细胞的激素分泌有促进作用；滋阴拆方仅对颗粒细胞分泌E2有刺激作用，对睾酮及孕酮的分泌有抑制趋势；调理冲任拆方对性腺细胞的激素分泌没有明显影响。

本研究中，应用CDDP后，小鼠血清E2明显降低；FSH明显升高，这可能与CDDP损伤卵巢功能后腺垂体代偿性调节有关。

CDDP给药后还降低了卵巢激素水平和生育率，小鼠每一动情周期性所排卵子数量明显减低。

二仙汤灌胃两周后，明显改善了小鼠的卵巢功能，降低了FSH和LH水平，提高了E2和P水平，卵泡的闭锁明显减少。

CDDP用药后，小鼠卵巢中MDA呈明显升高趋势，而T-AOC则表现为明显下降的趋势。

过氧化效应可直接导致MDA增加，从而使细胞外基质呈强表达[7]，由此推测，氧化损伤作用增强和总抗氧化损伤能力降低可能是CDDP导致小鼠POF形成的重要因素之一。

卵巢细胞中始基卵泡数量减少，有大量停止发育的原始卵泡，包膜增厚，窦前卵巢数量增加，卵泡成熟障碍，卵巢间质呈现不同程度的增生样改变，从而影响到卵巢细胞功能。

二仙汤给药后，小鼠卵巢中MDA呈明显降低，而T-AOC则表现为明显升高。