香稻两用核不育系琼香—1S空间诱变效应分析

香稻两用核不育系琼香—1S空间诱变效应分析摘要：为了改变香稻两用核不育系琼香-1S不抗白叶枯病的缺点，通过搭载返回式卫星将琼香-1S种子送入太空，在多种特殊综合因素作用下诱发突变。

调查SP0、SP1、SP2、SP3和SP4代的主要农艺性状；利用不同SSR引物进行分子水平检测，检测到11份太空诱变后代（SP4代）与留地原种琼香-1S的DNA扩增条带存在差别，说明香稻两用核不育系琼香-1S发生了变异。

并对琼香-1S及其变异后代（SP4代）进行白叶枯病抗性鉴定，筛选出免疫、高抗、抗白叶枯病的不育材料，对于更好地选育优质抗病水稻新组合具有较大实际生产意义。

关键词：香稻；核不育系；琼香-1S；空间诱变；白叶枯病；鉴定面对日益严峻的人口、资源、环境等问题，亟待探寻新的对策和措施。

实践证明，培育优良品种促进农业增产是最经济有效的措施[1]。

空间诱变是利用返回式卫星将农作物种子送入太空，在空间微重力、强辐射、高真空和弱地磁场等特殊综合因素的作用下引起后代产生形态、生理生化、产量、育性等特征特性的遗传变异。

空间诱变诱发变异频率高、变异谱宽、稳定快、育种周期短、易获得罕见变异类型，可以从中选育出优良品种（系）、具有特异性状的育种材料以及核不育系，近年来已发展成为一种育种新途径[2-4]。

琼香-1S是海南省农业科学院水稻研究所利用国外优质旱稻资源的一株结实率低的变异株，经多年定向选择育成的旱稻光温敏核不育系，2004年6月通过海南省科技厅组织的省级技术鉴定，12月通过海南省农作物品种审定委员会审定，其不育性稳定，组配组合优质性状遗传力强，异交结实率高，具茉莉花香味。

育性受光照、温度共同控制，属光温互作型，以光照为主，光照长度对温度有遮盖作用，是一种新的两用核不育材料类型[5]。

但生育期较长，不抗白叶枯病，为了解决这些不足，本研究将琼香-1S种子通过返回式卫星搭载进行空间诱变，希望获得抗白叶枯病且稳定的不育系材料。

1 材料与方法1.1 材料香稻两用核不育系琼香-1S。

1.2 处理方法取琼香-1S种子30 g搭载返回式科学与技术试验卫星进行空间诱变处理，30 g未作处理种子作为对照。

卫星于2008年10月15日17时10分在酒泉卫星发射中心由长征二号丙运载火箭发射升空，经过17 d轨道运行，于11月2日10时20分在四川省回收着陆。

1.3 田间种植与观察空间搭载种子当代（SP0）和对照种子于2008年冬在海南省三亚市种植，同时考察发芽率和出苗率。

成活单株移栽至大田，观察株高、抽穗期、株型、叶型等农艺性状，成熟后单株收种，用作第一代（SP1）种植用种。

2009年冬季在三亚市种植SP1代255份，2010年早季成熟后单株收种，获得10份变异材料，于2010年晚季在海南省澄迈县海南农业科学院粮食作物研究所基地种植这10个株系的SP2代，共500株材料，同期种植留地面的对照种子。

2010年冬保存稻蔸，2011年早季移栽大田种植SP3代，共13个变异株系650株材料；晚季种植SP4代，共2个变异株系（白色柱头和褐色柱头）200株材料。

从SP1代起各变异世代按株行种植，筛选育性、生育期、抗白叶枯病等变异单株。

1.4 琼香-1S空间诱变后代SP4代的DNA水平检测SP4代变异株和对照叶片DNA提取利用CTAB法[6]。

引物根据McCouch 等[7]发表的序列，由北京博彩生物公司合成，试验参照王丰等[8]使用引物以及根据能否清晰扩增出DNA条带进行初步筛选，选用分布在第2和第10染色体上的2对SSR引物。

PCR反应体系25 μL：模板DNA（浓度约10 ng/μL）2.5 μL，Mixture（0.1 U/μL Taq酶、Buffer、Mg2+、dNTP的混合液）12.5 μL，上下游引物（浓度约20 μmol/mL）各1 μL，ddH2O 8 μL。

反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.5 空间诱变后代白叶枯病抗性试验选择致病性强的菲律宾P6菌群，按照韩龙植等[9]“水稻种质资源描述规范和数据标准方法”培养菌株，从SP4代种植材料中选出变异株，共16份材料，并随机选取10株对照材料，人工剪叶接种鉴定，待病情发展稳定后（约接种14～21 d）进行观察。

2 结果与分析2.1 琼香-1S空间诱变后代的田间表现琼香-1S SP0代种子发芽率和出苗率及株高、抽穗期、株型、叶型、结实率等方面均与对照无明显差异；SP1代出现了株高、粒形、有芒、早熟、晚熟等10个变异单株；SP2代中，长粒和宽粒性状回复突变，但又新增了其他变异，其中有5个单株出现黄色小柱头，7个单株柱头为白色，另1个单株柱头黄、白色皆有，且为大柱头；SP3代大部分性状均已稳定遗传，但柱头大小和颜色还在继续分离，新分离出了白色柱头和褐色大柱头2种变异类型（表1）。

2.2 琼香-1S空间诱变后代SP4代的DNA水平检测结果利用不同SSR引物对琼香-1S空间诱变后代SP4代材料与对照进行PCR扩增，以检测二者分子水平的差异。

检测结果（图1）表明留地原种琼香-1S与SP4代16份材料间DNA扩增条带存在差别，说明琼香-1S发生了空间变异。

利用引物RM138所扩增的产物中，有2份材料扩增出对照不具有的DNA片段（图1a），说明这2份材料的DNA水平发生变异。

利用引物RM526所扩增的产物中，有8份材料扩增出与对照位置不同的DNA片段，说明这些材料的DNA片段可能发生了少数碱基的插入与缺失突变；还有2份材料没有扩增出DNA片段，说明这2份材料的DNA可能发生了碱基突变或较大片段的缺失（图1b）。

2.3 琼香-1S 空间诱变后代SP4代白叶枯病抗性试验白叶枯病调查参考“水稻白叶枯病病情记载和抗性评价标准”[9]，结果见表2。

由表2可知，10株琼香-1S对照中，中抗3株，感5株，高感2株；16株空间诱变后代中，免疫1株，高抗3株，抗5株，中抗6株。

空间诱变后代中，免疫与高抗白叶枯病的样品占鉴定样本数的25%，说明空间诱变后代白叶枯病抗性增强，并且获得了免疫和高抗材料。

16株SP4代中，有4株在分子水平上没有检测到变异，分别为1株高抗、1株抗病、2株中抗白叶枯病的样品，其余在分子水平上均检测到变异。

3 讨论3.1 空间诱变表型变异的特点杨利平等[10]研究表明，空间飞行虽然利用高真空、微重力和强辐射等空间条件进行植物诱变，但其经过处理植物种子发育成的SP1代植株常常会出现嵌合体和隐性突变，需经过1～2代的性状分离才可使隐性突变显现出来。

李源祥等[11]研究表明，SP1代主要性状与对照差异不明显，SP2代群体单株间主要农艺性状出现了广泛分离，变异幅度大、变幅极差大、变异系数大、变异频率高；各种性状变异均向有利和不利方向突变；单株间出现一些有利的特殊突变体，有的出现了生理性变异，在后代不能保存下来，有的产生遗传性变异，可稳定地遗传下去。

本研究结果表明，琼香-1S种子经返回式卫星搭载后，SP0代种子发芽率和出苗率、株高、抽穗期、株型、叶型、结实率方面均与对照基本无差异，SP1代出现了一些株高、粒形、有芒、长穗、早熟、晚熟等变异株，SP2代出现柱头颜色、大小，花药大小变异株；SP3代还有少量性状分离，如柱头颜色、大小等，但SP4代基本稳定。

这与上述研究结果类似。

3.2 空间诱变后代DNA水平变异本研究中，和对照原始留地种子相比，既扩增出对照不具有的DNA片段，也扩增出与对照位置有差别的DNA片段，还可以扩增不出相应DNA片段。

这也可以说明空间诱变变异的广泛性，跟表型变异的结果相一致。

DNA水平上的变异是表型变异的内在原因之一。

人们通常认为空间诱变与物理化学因素诱变仅产生少数碱基位点的点突变不同。

李永辉[12]研究利用SSR标记扩增产物的带型记录结果均是以分子量增减和条带数增加为主，是否空间诱变使水稻染色体上的DNA发生了重复或缺失等结构性变化，还有待进一步通过对扩增片段的DNA序列测定进行验证。

3.3 空间诱变后代的利用选择合适的搭载材料是选育出新品种的关键之一。

国家高技术航天领域专家委员会空间科学及应用专家于1998年2月在广州制定的《农作物空间诱变育种规范》中第一项对搭载材料的要求第1条为：根据育种目标选用综合性状优良，但1～2个性状有明显缺陷的地方主栽品种、新推广品种、准备推出的优良品系、杂交组合亲本或低世代杂种（F1）作为搭载材料。

香稻琼香-1S是一种新的两用核不育材料类型，但感白叶枯病，影响进一步应用。

因此本研究中经过连续选择获得的免疫、高抗、抗白叶枯病且稳定的不育系材料，对于更好地选育优质抗病水稻新组合具有实际生产意义。

参考文献：[1] 刘录祥，郑企成.空间诱变与作物改良[J].中国核科技报告，1997（S1）：1-11.[2] 郑家团，谢华安，王乌齐，等.水稻航天诱变育种研究进展与应用前景[J].分子植物育种，2003，15（3）：367-371.[3] 曹墨菊，荣廷昭，潘光堂.首例航天诱变玉米雄性不育突变体的遗传分析[J].遗传学报，2003，30（9）：817-822.[4] 李源祥，华育坚，蒋兴村，等.水稻空间诱变性状变异及育种研究[J].江西农业学报，2000，12（2）：17-23.[5] 郭国强，郭名奇，孟卫东，等.优质籼型旱稻光温敏核不育系琼香-1S的选育与应用[J].广西农业科学，2005，36（5）：399-400.[6] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002.744.[7] MCCOUCH S R，TEYTELMAN L，XU Y，et al. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice（Oryza sativa L.）[J].DNA Research，2002，9：199-207.[8] 王丰，李永辉，柳武革，等.水稻不育系培矮64S的空间诱变效应及后代的SSR分析[J].核农学报，2006，20（6）：449-453.[9] 韩龙植，魏兴华，曹桂兰，等.水稻种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2006.112-113.[10] 杨利平，张数方，丁冰.卫星搭载对露地菊后代遗传性的影响[J].空间科学学报，1996，16（增刊）：166.[11] 李源祥，蒋兴村，李金国，等.水稻空间诱变育种的研究[J].航天医学与医学工程，1998（11）：21-25.[12] 李永辉.水稻不育系培矮64S空间诱变效应及其变异后代分子标记分析[D].南昌：江西农业大学，2007.。