第3章 核酸序列分析

DNA序列分析基本内容 序列分析基本内容
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序列一般性分析 基因识别与鉴定 非编码区分析及调控元件识别
一、序列统计
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1 基本指标统计
序列统计包括核酸序列基本指标的计算：分子质量、GC百 序列统计包括核酸序列基本指标的计算：分子质量、GC百 分含量、融合温度（Tm值 又称退火温度）、 ）、摩尔消光系 分含量、融合温度（Tm值，又称退火温度）、摩尔消光系 数等。可通过一些常用软件如JaMBW JaMBW软件包中的一个小工 数等。可通过一些常用软件如JaMBW软件包中的一个小工 Calculator、BioEdit、DNAMAN等进行综合计算 等进行综合计算。 具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等进行综合计算。 Oligo Calculator , /JaMBW/
Emulsion PCR Colony/Cluster
Sequence Read and Assembly
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
Sequential Sequence Extension Reaction
三、基因测序的应用
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以应用为主导的基因组学将阔步走向未来
• 走向人类的健康与生活 • 走向人类赖以生存的物质基
础 • 走向人类赖以生存的环境 • 走上人类社会和经济发展的 大舞台
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1 基因组学研究成果将走近人类的健康与生活
• 疾病相关基因的发现、功能的鉴定和分子机制 疾病相关基因的发现、
的探讨
一、第一代测序技术
7
大规模基因组测序的几个支撑技术
Sanger双脱氧末端终止法（1977） Sanger双脱氧末端终止法（1977） 双脱氧末端终止法 PCR 技术（1985） 技术（1985） DNA 自动测序仪的发展（ABI,1995） 自动测序仪的发展（ABI,1995） 生物信息学分析软硬件设施
100um
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25 Cycles Achieved on a Surface
5
4
Raw intensity values
3
2
C G A T
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425
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Solexa Genome Analyzer Workflow
• • • • • •
突破常见病（复杂疾病）基因水平的研究 突破常见病（复杂疾病） 以基因为基础的疾病诊断、预测和预防 以基因为基础的疾病诊断、 基因治疗与细胞治疗治疗的结合 以基因多态性为基础的“个体化” 以基因多态性为基础的“个体化”药物 以基因多态性为基础的“个体健康计划” 以基因多态性为基础的“个体健康计划” 传统药物、生物药物和“有机药物” 传统药物、生物药物和“有机药物”的自然回 归
SOLiD – ABI/Agencourt
SBL with dual base encoding
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Individual Frame Image of Single Molecule Fluorescence
Hundreds of single molecules detected by CCD camera
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2 走向人类赖以生存的物质基础
• 抗病、抗虫和抗极端环境的农作物 抗病、 • 高生殖率、高生长率、高营养率的家畜、家禽 高生殖率、高生长率、高营养率的家畜、
和水产品新品种
• 维生素和营养物质富集的水果和蔬菜 • 生物杀虫剂、除草剂和抗病药物 生物杀虫剂、 • 微生态环境下生产的有机食品
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3 走向人类赖以生存的环境
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Sequence by Synthesis
is a cyclic process involving multiple rounds of • A) incorporation of fluorescent nucleotide • B) washing • C) imaging • D) cleaving label
Polymerase Ligase
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Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators (FISSEQ)
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
• 全基因组霰弹法-鸟枪法（Whole Genome Shot-gun) 全基因组霰弹法-鸟枪法（ Shot把基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。 左右的小片段，测序并拼接。 把基因组直接打碎成 左右的小片段
逐步克隆法（ 逐步克隆法（Clone by Clone） ）
基因组DNA 基因组
19
20
Next-Gen Sequencing Workflow
Fragment Library Preparation
Random Pair-end
Immobilization of Fragment
Surface, Bead Covalent or noncovalent
Clonal Amplification
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“双脱氧末端终止”的含 双脱氧末端终止” 义 1977） （1977）
Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
9
10
大规模基因组测序的两种策 略
• 逐步克隆法--基于BAC的方法（Clone by Clone） 逐步克隆法--基于BAC的方法（ --基于BAC的方法 Clone）
先把基因组打碎成200－300kb的片段并制成 － 的片段并制成BAC文 先把基因组打碎成 的片段并制成 文 进一步打碎成3kb左右的小片段， 左右的小片段， 库，再选择一些BAC进一步打碎成 再选择一些 进一步打碎成 左右的小片段 测序并拼接( 克隆的覆盖率不应低于3倍 ， 测序并拼接 BAC克隆的覆盖率不应低于 倍)，。 克隆的覆盖率不应低于
• 已形成了一条世界第六、亚洲最大的基因组测序 已形成了一条世界第六、 技术平台，共有MegaBACE测序仪 测序仪104台， 技术平台，共有 测序仪 台 ABI3730测序仪 台，ABI377测序仪 台，满负荷 测序仪2台 测序仪11台 测序仪 测序仪 运转日产可达50Mb，是一个低投入、高产出，高 运转日产可达 ，是一个低投入、高产出， 度自动化的测序平台。 度自动化的测序平台。
11 或contig
测序并进行 全基因组序 列组装
ห้องสมุดไป่ตู้
霰弹法克隆 用于霰弹法测 序的候选克隆 用于霰弹法测序 的亚克隆 测序并组装 ………ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA…… 完整的基因 ………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA… 组序列 …
Sequencing Cost（成本） （成本）
Sample handling Difficult to miniaturize
18 $3,000 millions per human genome (phg) in 1984 $300 millions phg in 1994 $30 millions phg in 2004 $10 millions phg in 2005 NHGRI’s Immediate Goal by 2009: $100,000 phg $2 millions Watson’s genome with 454 in 2007 $60,000 phg (ABI claim in Mar. 2008) Goal by 2014: $1000 per human genome
• 基因组信息记录了物种亿万年来在环境变迁中 起源和进化的历史。 起源和进化的历史。 • 生物多样性资源的研究、保护与开发：地球上 生物多样性资源的研究、保护与开发： 估计有1 估计有1亿个物种 • 生态环境的研究、保护与开发： 生态环境的研究、保护与开发： – 巨大的海洋（占地球总面积71％） 巨大的海洋（占地球总面积71 71％） – 广袤的森林（占地球总面积40％） 广袤的森林（占地球总面积40 40％） – 诸多的湖泊与河流大规模测序平台的构成组 培养组 模板组 电泳组 反应组
MegaBACE 基因组随机的构建13含有质粒载体的大肠杆菌培养 测序模板的制备 检测模板质量与测序定量 测序反应与纯化 反应产物上机测序 序列数据的接收、质量评估、 序列数据的接收、质量评估、 组装等
上机组 数据处理组
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中国基因组测序情况
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我国测序能力的“三级跳”
• 人类基因组计划1%项目的 finishing (1999年) • 中-丹合作的家猪基因组计 划 (2000年) • 水稻工作框架图的绘制和 公布 (2001年) • 标志着我国已掌握了国际 先进的测序技术，具有相 当的测序能力。 • 测序能力和质量已达到国 际一流水平 ,以独立承担大 规模的基因组测序项目 • 我国已经成为继美国之后 世界上第二个具有独立完 成大规模的全基因组测序 和组装分析能力的国家
第三章 DNA序列分析 序列分析
2 免费分子生物学软件下载网址： 免费分子生物学软件下载网址：
Ebi
/software/software.html 或ftp:///pub/sofware/
Iubio （印地安纳州大学
/soft/molbio/ 或 ftp:///soft/molbio/
§3.2 DNA序列的一般分析 序列的一般分析
基因结构与功能简介 原核生物基因结构
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特点： 特点：
1 长开放阅读框 2 高基因密度 3 简单的基因结构 基因组中GC GC含量变化非常大 4 基因组中GC含量变化非常大
真核生物基因结构
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1 基因组规模大 特点： 特点： 非编码区序列占绝大部分（人类，97％） 2 非编码区序列占绝大部分（人类，97％） 3 基因结构复杂 4 具有复杂的基因转录调控方式 5 具有丰富的可变剪接 有明显的CpG CpG岛 6 有明显的CpG岛、密码子使用具有偏好性
Iubio Archive 主页 每一个文件夹里都有相关的免费软件可供下载
3
4
主要内容 §3.1 核酸序列测定 §3.2 序列的一般分析 §3.3 基因预测与鉴定 §3.4 非编码区分析与调控元件识别
§3.1核酸序列测定
世界大型基因组研究中心
6
美国： 美国：1) National Human Genome Research Institution in NIH 2) Genome Center at White Head/MIT 3) Washington University Genome Center 4) Joint Genome Institution at DOE 5) Genome Center at Baylor Medical Collage 英国： 英国：Sanger Center 日本： 日本：RIKEN 中国：华大基因研究中心（北京、杭州） 中国：华大基因研究中心（北京、杭州） 国家人类基因组中心（北京、上海） 国家人类基因组中心（北京、上海）
基因组DNA 基因组
全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun)
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两种大规模基因组测序策略的比较
策 略 项 目 遗传背景 速度 费用 计算机性能 适用范围 代表测序物种 全基因组霰弹法 不需要 快 低 高（以全基因组为单位 进行拼接） 进行拼接） 工作框架图 果蝇、 果蝇、水稻 逐步克隆法 需要（ 需要（需构建精确的物 理图谱） 理图谱） 慢 高 低（以BAC为单位进 为单位进 行拼接） 行拼接） 精细图 人、线虫
二、第二代测序技术
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2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
第一代测序技术的局限性
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Limitation of 1st Gen Sequencer
Throughput （通量） 通量）
Time-consuming separation of chainterminated fragments Hard to produce massively parallel system based electrophoretic separation