雷公藤多苷对变应性接触性皮炎小鼠干扰素诱导蛋白10及其受体表达的影响

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(收稿日期:2017 -04-08)
D O I：10.3969/j.issn.1671 -4695.2017.12.003文章编号=1671 -4695(2017)12 -1151 -03
雷公藤多苷对变应性接触性皮炎小鼠
干扰素诱导蛋白10及其受体表达的影响
李艳华1许建张振刚3于腾4杜琳5(1济宁市传染病医院中西医结合科；
2济宁市疾病预防控制中心职业卫生科；3济宁市中西医结合医院妇产科；
4济宁市第一人民医院皮肤科；5济宁医学院护理学院山东济宁272000)
【摘要】目的观察雷公藤多香对变应性接触性皮炎（A C D)小鼠体外培养脾淋巴细胞干扰素诱导蛋白10(I P- 10)及其受体C X C R3表达的影响，进一步探讨雷公藤多香治疗A⑶的机制。

方法以雷公藤多香和RP M I - 1640培养 液，制备不同浓度雷公藤多香培养液（高、中、低浓度组分别为5. 0 mg/L、l.0 mg/L、0. 5 mg/L),以不含有雷公藤多香的 培养液孔为空白对照。

检测不同浓度雷公藤多香溶液体外培养48 h后的A C D小鼠脾淋巴细胞中I P-10/C X C R3的表 达，用逆转录聚合酶链反应（1^-?01)检测圯-10,流式细胞术检测匚乂。

113。

结果雷公藤多香体外培养各组人。

0小鼠脾淋巴细胞中IP- 10 m R N A表达水平较之对照组受到抑制（P <0.05);与对照组比较，高、中浓度组表达水平降低明 显（P <0.05),呈现出剂量依赖性。

雷公藤多香各浓度组体外培养的A⑶小鼠脾淋巴细胞表面C X C R3分子表达与对照组比较均降低，但仅高浓度组抑制明显（P <0.05);高浓度组C X C R3分子表达水平低于低浓度组（P<0.05)结论雷公藤多香可以抑制体外培养A C D小鼠脾淋巴细胞中I P-10 m R N A及其受体C X C R3的表达，对I P-10 m R N A的抑 制呈现剂量依赖性，抑制或减轻炎症的产生，可能是雷公藤治疗A C D机制之一。

【关键词】小鼠变应性接触性皮炎雷公藤多香干扰素诱导蛋白10趋化因子受体3
Effects of Tripterygium Glycosides on the expression of interferon inducible protein 10 and its receptor in allergic contact dermatitis mice. LI Yan - hua1, XU Jian2, ZHANG Zhen -gang3, et al.1Department o f Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Infectious Disease Hospital o f Jining；2 Occupational Health Section, Jining Center for Disease Control and Prevention；3 Obstetrics and Gynecology, Jining NO.1Peoples Hospital, Jining Shandong 272000, China.
【Abstract】Objective In order to observe the effect of Tripterygium Glycosides on IP - 10/CXCR3 in ACD mouse, thus further to discuss the mechanism of this medicine in the treatment of contact dermatitis. Methods Different concentrations of Tripterygium wilfordii were prepared (the high, medium and low concentration groups were 5. 0 mg/L ,1.0mg/L ,0.5m g/L) , and the culture medium containing no tripterygium glyco­sides was used as blank control. The expression of IP - 10/CXCR3 in vitro culture of ACD mouse which incubation with Tripterygium Glycosides were detected by RT -PCR and flow cytometry. Results Compared with the control group, all of the three different concentration groups of Tripterygium Glycosides could remarkably suppress the expression of IP -10mRNA in vitro culture Splenic lymphocyte of ACD mouse ( P<0. 05). Compared with the control group, the expression level of high concentration group was significantly reduced ( P< 0. 05). Compared with the con­trol group, cultured ACD mouse spleen lymphocyte surface expression of CXCR3 of Tripterygium Glycosides groups decreased, but only the high concentration group decreased significantly ( P<0.05). The CXCR3 expression level of high concentration group was lower than that of the low
通讯作者：许建，E - mail:xujian20040703@ 126. com
• 1152•Journal o f Clinical and Experimental Medicine Vol.16 , No.12 Jun. 2017
concentration group ( P<0• 05) •Conclusion Tripterygium Glycosides can obviously suppress the expression of IP - 10/CXCR3 in vitro culture lymphocyte of ACD mouse, which maybe one of the mechanisms of Tripterygium Glycosides"treatment on ACD.
【Key words】Mice;Allergic contact dermatitis; Tripterygium Glycosides; Interferon - inducible protein 10 ; Chemokine receptor CXCR3
变应性接触性皮炎（allergic contact dermatitis，A C D)是常见的变态反应性疾病，发病机制复杂，趋化因 子干扰素诱导蛋白10 (IP - 10)及其受体C X C R3 (Che-mokine receptor)在A C D发病中的作用日渐受到重视[1]。

雷公藤具有强大的抗炎及免疫抑制的作用，其治 疗A C D的效果很好，但其机制尚未完全明确。

笔者于 2015年10月至2016年4月通过动物实验，采用不同浓 度雷公藤多苷溶液与小鼠脾淋巴细胞共同体外培养的 实验方法，观察雷公藤多苷对体外培养A C D小鼠淋巴 细胞趋化因子IP-10及其受体C X C R3表达的影响，探 讨雷公藤治疗A C D的机制。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物清洁级昆明种雄性小鼠44只，体质 量18〜22 g，购自济宁医学院实验动物中心。

1.1.2主要试剂及仪器5%及1%二硝氯苯丙酮溶 液;双抗（Sigma);雷公藤多苷片（湖南协力）；P E标记 抗鼠C X C R3荧光抗体（晶美）；超净工作台（苏净）；流 式细胞仪（B D);电泳仪（北京六一）；荧光定量P C R仪 (A B I);蛋白核酸定量测定仪（Eppendorf);凝胶成像系 统（伯乐）；R T- P C R试剂盒（大连宝生物）。

1.2方法
1.2.1分组实验动物随机分为4组，每组11只，诱 发变应性接触性皮炎后分为对照组和雷公藤多苷高、中、低浓度组（浓度分别为5.0 mg/L、1.0 mg/L、0. 5 mg/L)〇
1.2.2 A C D小鼠模型的建立按文献m方法，稍作修改，刮除小鼠背部毛发，面积约2〜3 c m2，暴露皮肤处外 涂5%二硝氯苯丙酮溶液100 p i致敏;10 d后，于小鼠 耳廓内外两侧涂1%二硝氯苯丙酮溶液30 p i激发。

1周后用1%D N C B刺激1次，连续重复4周。

最后一次 激发24 h后，观察皮损严重度并切取皮肤及右耳做组 织病理检查。

1.2.3雷公藤多苷溶液制备称取10 m g雷公藤多苷，以1m l二甲基亚砜溶解，加入RPMI - 1640培养 液，调配成浓度为50 p g/m l的溶液，滤菌分装。

1.2.4脾淋巴细胞分离培养小鼠颈椎脱臼处死，无 菌摘取脾脏后放入培养皿中，研磨至白色絮状，以Hanks液冲洗、过滤，收集脾细胞悬液于无菌离心管中，1 500 r/m i n离心5 m i n后弃上清，反复两次;以RPMI- 1640培养液悬浮细胞计数，调整细胞浓度为2 x 106/ m l;每培养孔加0.5 m l细胞，然后分别加入高、中、低浓 度雷公藤多苷培养液，同时以只加有脾细胞悬液的培养 液孔为空白对照;混匀后放入37°C，5%C02的温箱内，培养48 h后进行实验检测。

1.2.5 R T- P C R法检测IP - 10 m R N A根据试剂说 明书要求，以细胞总R N A Trizol试剂提取R N A，260 n m 和280 m n波长范围内，使用紫外分光光度计法检测R N A浓度和纯度。

将扩增后R N A放入1.2%的琼脂糖 凝胶中电泳，进行凝胶成像分析。

内参基因为G A P D H，弓1
G A A A G C A-3； 5^-T C T G T G G G T C C A T C C T T G G A A-3^；
G A P D H:5G C A C C G T C A A G G C T A G A A C - 3 y- T G G T-G A A G A C G C C A G T G G A - 3^宝生物工程公司设计合成）。

测定小鼠脾淋巴细胞中IP - 10 m R N A的相对表 达量。

根据扩增曲线、溶解曲线以及阈值得C t值，2 _AACT法测定IP-10 m R N A的相对表达量。

1.2.6流式细胞术检测C X C R3 吸取培养孔内细胞 入离心管，离心5 min(l 500 r/min),弃上清;1m l憐酸 盐缓冲液(P B S)重悬细胞，分入2个流式试管中；分别 离心，弃上清液，洗涤细胞1次，吸弃上清;每管分别加 入10 j j J PE anti- mouse C X C R3 ;震荡，室温避光保存30 min;加入500 pi4%多聚甲醛，流式细胞仪检测。

1.3统计学处理应用SPSS 11.5软件对实验数据统 计分析，计量资料以均数±标准差（* ± O表示，数据 比较采用方差分析和t检验。

以P<〇. 05为差异有统 计学意义。

2结果
2.1各组小鼠脾淋巴细胞IP- 10 m R N A的表达比较
雷公藤多苷体外培养各组A C D小鼠脾淋巴细胞中
I P-10 m R N A表达水平较之对照组受到抑制（P<
0.01);与对照组比较，高、中浓度组表达水平降低明显 (t=-3.591,t= -3.207, P <0.01) 〇
表1不同浓度组雷公藤多苷与对照组小鼠
脾淋巴细胞IP - 10 m RN A的表达比较（* ± s )
组别浓度（m g/L)IP -10 mRNA
高浓度组 5.00.607 ±0. 143
中浓度组 1.00.659 ±0.099
低浓度组0.50.693 ±0.172
对照组00.925 ±0.256
續 6.911
P值0.001
2.2各组小鼠C X C R3的表达比较与对照组比较，雷公藤多苷各浓度组体外培养的A C D小鼠脾淋巴细 胞表面C X C R3分子表达均降低，但仅高浓度组抑制明 显（t = -
3.597, P =0.001 <0.01);高浓度组 C X C R3 分子表达水平低于低浓度组（f = -
4.14, P =0.001 < 0.01)。

见表 2。

<14珠和实验2017 + 6 |第16 |第12期• 1153•
表2不同浓度组雷公藤多苷与对照组小鼠脾淋巴细胞CXCR3的表达比较组别浓度（
mg/L)CXCR3 (% )高浓度组
5.0 5.42 ±0.73
中浓度组
1.0 6.47 ±1.81
低浓度组
0.57.26 ±1.56
对照组
07.74 ±2.39
續 5.168
P值0.03
3讨论
干扰素诱导蛋白（IP-10)是由干扰素7 (IFN- 7)/ 或脂多糖诱导产生的一类属于C X C类亚家族的趋化因 子，其可与表达在T细胞表面的受体趋化因子C X C R3 结合促进其活化，招募T淋巴细胞、单核巨嗟细胞等免 疫细胞向病变部位聚集，促进炎症反应[3]。

研究发现，在毛细支气管炎患儿外周血淋巴细胞及结核性胸膜炎 患者外周血血清中IP - 10/C X C R3的表达均增加[4’5]，而未经治疗的HIV/A I D S患者外周血中IP - 10显著高 于正常人[6]，提示IP- 10/C X C R3参与了疾病的免疫应 答过程和炎性反应。

A C D是一种由C D4 +T h l细胞介导 的IV型变态反应，IP -10在A C D中表达，其受体C X-C R3在A C D中也呈优势表达[7]。

有研究推测[8]，A C D 中匸1〇13与正-10结合，诱导更多的几1细胞聚集，介导免疫反应。

雷公藤多苷是雷公藤根的水-氯仿提取物，具有强 大的抗炎和免疫抑制作用，单用或联合应用于多种免疫 性及变应性皮肤病的治疗，取得了良好疗效[9]。

徐晓光 等[1°]研究发现，经雷公藤多苷片治疗后的自身免疫性 甲状腺炎大鼠，外周血细胞中的C X C R3 m R N A表达减 少，推测可能是通过调整C X C R3的水平而抑制炎症的 发生。

岳致丰等[11]研究发现，雷公藤多甙治疗后的银 屑病患者外周血C D4 +细胞降低至正常水平，推测雷公 藤多甙可能通过抑制外周血中C D4 +细胞的活化，使进 入皮损内的C D4 +细胞数减少，从而抑制C D4 +细胞释 放细胞因子，表明雷公藤多甙可有效抑制银屑病患者外 周血T淋巴细胞亚群活性，而A C D正是一种由C D4 + T h l细胞介导的变态反应。

罗育武等[12]曾经使用雷公 藤多甙片治疗A C D，疗效较好。

为了进一步探讨雷公藤治疗A C D的可能机制，本 实验采用不同浓度雷公藤多苷溶液与小鼠脾淋巴细胞 共同体外培养的实验方法，观察了雷公藤多苷对A C D 小鼠脾淋巴细胞中IP-10/C X C R3表达的影响，区别于 张玉环等[13]采用的血清药理学方法。

本研究结果显 示，雷公藤多苷可明显抑制A C D小鼠脾淋巴细胞中IP -10 m R N A的表达，与浓度高低具有一定关系，呈现出 剂量依赖性。

本实验中，雷公藤多苷也抑制了体外培养 的A C D小鼠脾淋巴细胞表面C X C R3的表达，仅高浓度 抑制效果明显（P <〇.〇5)。

本研究与张玉环等[13]使用 含药学清培养方法检测A C D小鼠外周血中C X C R3的表达结果相似。

笔者曾经以A C D患者作为研究对象，研究雷公藤多苷对患者外周血淋巴细胞IP- 10/C X C R3 表达的影响，本实验结果与其相似[14]。

因此笔者推测，由于雷公藤多苷抑制了 A C D淋巴细胞中IP - 10及其 受体C X C R3的表达，诱导了 T细胞的凋亡，减少了 T细 胞的数量，使炎细胞不能移行、聚集到局部受损皮肤，从 而减轻或抑制了炎症的产生，可能是雷公藤治疗A C D
机制之一'0
4结论
雷公藤多苷可以抑制体外培养A C D小鼠脾淋巴细 胞中IP-10 m R N A及其受体C X C R3的表达，对IP- 10 m R N A的抑制呈现剂量依赖性，抑制或减轻炎症的产 生，可能是雷公藤治疗A C D的机制之一。

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