解脲脲原体和微小脲原体相对定量荧光PCR方法的建立及应用

中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
J ournal o f Pa th ogen H io l ogy Dec.2020.Vol.15.No.12
・1422・
D()I：10.13350/j.cjpb.201211 •论著•解麻麻原体和微小眠原体相对定量荧光PCR方法
的建立及应用*
孟凡亮‘，李晶：.龚杰‘，何利华［，张建中1,赵飞
(1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所.传染病预防控制国家重点实验室.北京102206；2.中国疾病预防控制中心
实验室管理处)
目的建立一种含内参基因的解脈9S原体(Uu)ffl微小豚原体(Up)相对定量的荧光PCR分型方法，克服标本采样差异对检测结果的影响.了解患者豚原体感染的生物分群及病原载啟。

方法设计Uu和Up检测与分型引物探针.使用人p-globin(BG)作为相对定量内参引物探针.建立Uu、Up和BG的三重荧光PCR方法.使用核酸标准品建立标准曲线•计算宿主细胞中Uu或Up的相对含量.并确定体系Uu和Up检测下限。

使用20株Uu.30株Up临床分离株以及22种生殖道常见病原体进行体系灵敏度和特异性验证，并对68例豚原体阳性生殖道标本进行分型和相对定址分析。

结果建立的荧光PCR方法对Uu和Up的检测限均为10拷贝，20株Uu利130株Up临床分离株均可正确分型，对22种生殖道道常见微生物无交叉反应。

68份豚原体阳性临床标本Uu阳性率为35.3%(24/68),Up阳性率
58.8%(40/68),Uu+Up阳性率为5.9%(4/68),分型结果与文献报道的方法一致性为97.1%。

标本定量检测显示.Uu
阳性标本的中位数为4076拷贝/10'细胞.Up阳性标本的中位数为2092拷贝/10'细胞。

结论建立荧光PCR分型方法可快速完成Uu和Up分型，获得致病型脉原体诊断结果•并通过相对定量反映宿主细胞粘附的病原体量，克服采样差异对检测结果的影响，更客观地反映豚原体载最和致病力。

关键词】解豚眼原体；微小脉原体；内参；定量PCR；基因分型
中图分类号】R374【文献标识码】1673-5234(2020)12-1422-05
ournal of Pathogen Biology.2020Dec；15(12):1422—1426.]
The establishment and clinical use of a Urea plasma urealyticum and Urea plasma parvum relative quanti­tative PCR assay
MENG Fan-liang1,LI Jing-,GONG Jie1,HE Li-hua1,ZHANG Jian-zhong1•ZHAO Fei1(1.Na tional Institute for Com municable Disease Control and Prevention.Chinese Center for Disease Control and Pre-vention;
State Key Laboratory for Infectious Disease Preventiim and Control,Beijing,Chijia,102206；2.Office of Laborato­ry Management.Chinese Center for Disease Control and Prevention)
Objectives To establish a relative quantitative fluorescent PCR technique to detect Urea plasma urealytic urn and Urea plasma parvum.This novel method does not affect the accuracy of detection results due to sampling differ­ences.Therefore,this method can be used to analyze the biological classification and pathogen load of a Ureaplasma infec­tion in patients.Methods Specific real-time PCR was designed for U.urealyticum and U.parvum・and the human(3-globin gene(BG)was selected as a quantitative internal standard.Three originally independent real-time PCR methods were combined into a single-tube multiple real-time PCR.Standard curves were plotted using a set of nucleic acid stand­ards.Therefore,the detection limits of U.urealyticum and U.parvum was determined,and the relative content of17.
urealyticum and U.parvum relative to the host cell were also effectively calculated.Twenty U.urealyticum clinical iso­lates,30U.parvum clinical isolates,and22common reproductive tract pathogens were used to verify the sensitivity and specificity of this novel method.Sixty-eight confirmed Ureaplasma-positive genital tract specimens were tested and quan­titatively analyzed.Results The lower detection limits of U.urealyticum and U.parvum were both10copies.Twen­ty U.urealyticum and3017.parvum clinical isolates were all correctly identified.The novel method did not cross-react with22common reproductive tract microorganisms.Sixty-eight68Ureaplasma-positive clinical specimens tested positive for17.urealyticum at a rate of35.3%(24/68),positive for U.parvum at a rate of5&8%(40/68)・and positive for both pathogens at a rate of5.9%(4/68).The result was97.1%consistent with methods reported in the literature.
【基金项目】【通讯作者】【作者简介】“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项(No.2O18ZX1O714-OO2&2018ZX10712-001)0飞・E—mail:zhaofei@
孟凡亮(1971—)，男，北京人，副主任技师，主要从事病原生物学研究。

E-mail:mengfanliang@
中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
Journal of Pathogen Biology Dec.2020,Vol.15,No.12・1423・
Results indicated that the median of17.urealyticutn-positive specimens was4♦076copies/10'cells»and the median of U.paruzz加-positive specimens was2,092copies/10'cells.Conclusion U.urealyticum and U.par-vum were identified using a new real-time PCR technique.Host cells were used as a quantitative internal standard to avoid the effects of sam­pling differences.Therefore,this method indicated the Ureaplasma load and pathogenicity.
I Key wordsl Ureaplasma urealyticum；Urea plasma parvum；internal control；quantitative PCR；genotype
解服腺原体（Ureaplasma urealyticum,UU）是人类泌尿生殖道常见条件致病菌，与非淋病性尿道炎、生殖道感染以及早产儿呼吸窘迫综合征等多种疾病密切相关I'：。

UU包含两个生物群和14个血清型，生物I群包括1、3、6、14共4个血清型，生物II群包括2、5、8、9以及7-13共10个血清型:'多数学者认为两大生物群具有不同的生物特性.应划分为两个独立的物种。

2007年国际细菌学分类学会将解豚腺原体的两个生物群定义为两个新的种，即微小际原体（Ure­aplasma parvum,Up生物I群）和解豚麻原体（Ure­aplasma urealyticum,Uu生物II群）。

研究表明，Uu和Up无论在基因序列、培养特性还是致病性方面，都存在较大差异。

健康人群中以Up携带为主，但在盆腔炎、生殖道感染、流产等患者中Uu的检出率显著高于对照组，提示Uu与人类生殖道疾病的关系更为密切：6~8]o第3版《全国临床检验操作规程》中要求，为明确UU是否为致病病原体.对其进行Uu和Up分群是判断感染与携带的关键.在相关疾病的诊断中尤为重要。

此外，UU的携带量也是衡量其致病性的重要指标:"7"：，但泌尿生殖道标本检测易受采样量的影响，尚无准确的定量方法。

考虑到以上临床需求，本研究拟设计一种Uu和Up的荧光PCR分型方法，参考人乳头瘤病毒（human pap­illoma virus,HPV）定量方法"，引入宿主细胞p-glo-bin基因作为内参基因进行相对定量检测，形成一套三重荧光PCR定量体系，通过计算10'个宿主细胞所含的Uu或Up数量，同时实现临床标本中Uu和Up 分型和相对定量分析。

材料与方法
1材料
1.1菌株与标本解脉腺原体ATCC27618,微小腺原体ATCC27813,生殖支原体ATCC33530,人型支原体ATCC23114,穿透支原体ATCC55252,梨支原体ATCC25960，发酵支原体ATCC19989，肺炎支原体ATCC29342,无乳链球菌，B族链球菌，金黄葡萄球菌，表皮葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，沙眼衣原体邙日性核酸），淋病奈瑟氏菌，白色念珠菌，阴道加德纳菌，阴道毛滴虫（阳性核酸），HPV6、11、16和18型（阳性核酸）均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室保存。

68例UU 阳性的细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)患者标本由北京大学第一医院提供。

1.2主要试剂和仪器QIAamp DNA mini kit核酸提取试剂盒购自德国QIAgen公司；2X Taqman PCR mix购自美国Solarbio公司；Nuclease-free water购自美国Promega公司；QuantStudio"6Flex荧光PCR仪为美国ABI公司产品；Qubit3.0为Thermo Fisher公司产品。

2方法
2.1引物及探针的设计合成使用Primer Express
3.0软件，针对Uu和Up两个生物群的Urease基因特异性核酸序列分别设计各自检测引物探针，使用人p-globin(BG)引物探针工：作为相对定量内参(表1)。

引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

表1Uu、Up和内参荧光PCR引物和探针
Table1The quantitative PCR primers and probs of Uu Up and p-globin
引物/探针名称序列(5-3-)荧光标记Primer/prob name Sequence(5*3')Fluorescence U^F CCAGCTGCTGAATTAGCTAAGAAA
Uu-R GCTTCTGTTAGAGGTTCTGCATCA
Uu-P AAAACTGCAAACGGTAAAT5'6-FAM,3'MGB
Up-F TCAGGTGAARTTTATCGTTCTGATTT
Up-R TTTAGCTGAGGATTGTGTTGTAATGA
Up-P AAATTAATGATGATGCTCGTTG5'VIC,3'MGB
-BG-F CAGGTACGGCTGTCATCACTTAGA
-BG-R CATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTA
*BGP GCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG5'CY5,3'BHQl
注「BG引物探针出自文献可
Note：*BG Primer and prob cited by Ref12.
2.2荧光PCR体系的建立12.5讪2X Taqman PCR mix,0.4M1Uu-F(25M mol/L),0.4M1Uu-R(25 pimol/L),0.2“1Uu-P(25ptmol/L),0.4#1Up-F(25 jumol/L),0.4pil Up-R(25“mol/L),0.2“1Up-P(25 jxmol/L),0.4p.1BG-F(25pmol/L),0.4ptl BG-R(25 jzmol/L),0.2pil BG-P(25jxmol/L),4.5ptl Nuclease-free water,5.0#1DNA模板。

体系使用QuantStu-dio™6Flex荧光PCR仪扩增检测。

扩增条件：95C 10min；95C15s,60C30s,共45个循环。

2.3Uu、Up和BG标准曲线的建立分别使用含(0.2〜2)X10,拷贝/小的Uu(ATCC27618)和Up (ATCC27813)浓度梯度核酸标准品以及BG浓度梯度核酸质粒对体系建立相应的标准曲线•评价三重荧
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Journal of Pathogen Biology Dec.2020.Vol.15.No.12・1424・
光体系分别对Uu、Up和BG标准曲线的线性范围、扩增效率(E)、检测下限及标准曲线相关系数(R」)。

2.4体系的灵敏度和特异性检测使用QIAamp DNA mini kit核酸提取试剂盒提取实验室保存的20株Uu和30株Up菌株核酸，并对1.1中22种致病菌进行核酸提取。

使用Qubit
3.0测定提取的核酸浓度•所有病原核酸浓度均大于100pg/ul o使用提取的核酸进行体系特异性验证。

2.5临床标本Uu和Up分型检测及相对定量分析
68例UU阳性患者的BV标本分别使用常规Uu和Up分型方法"和本研究相对定量方法检测。

前者仅进行定性分型分析.后者进行Uu和Up的相对定量分析。

检测时分别设置Uu、Up和BG的10〜10*拷贝浓度核酸的标准曲线.每个标本依据检测CT值和其对应的标准曲线计算Uu或Up以及BG的拷贝数.进行标本中Uu或Up的相对定量分析：Q=QU/ QBGX10\式中Q代表10'个宿主细胞所含的Uu 或Up量，QU代表检测核酸中Uu或Up的基因拷贝数，QBG代表人p-globin的基因拷贝数。

结果
1荧光PCR标准曲线
建立的三重荧光PCR方法对于梯度浓度为10'
拷贝的Uu和Up标准菌株核酸浓度梯度标准品以及BG阳性质粒核酸标准品的线性检测范围均为10'〜10"拷贝，Uu、Up和BG的最低检测限均为10拷贝。

在10'~10s拷贝核酸浓度范围内，3种荧光标准曲线的扩增效率(E)和标准曲线相关系数(R：)见图1。

110s copies210'copies310'copies410'copies5101copies610'copies7102copies810*copies910"copy 图1—拷贝Uu(A)、Up(B)和BG(C)标准品荧光PCR体系扩增曲线及对数曲线
Fig.1Standard curve and log standard curve of real-time PCR assay by10°copy to108copies standard concentration plasmid of Uu l【p and p-globin
2荧光PCR体系的灵敏度和特异度
用该体系检测20株Uu和30株Up均为阳性，且之间无非特异性扩增。

生殖支原体，人型支原体.穿透支原体.梨支原体.发酵支原体.肺炎支原体.无乳链球菌.B族链球菌，金黄葡萄球菌，表皮葡萄球菌.鲍曼不动杆菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，沙眼衣原体.淋病奈瑟氏菌.白色念珠菌.阴道加德纳菌，阴道毛滴虫、HPV6、11、16和18型核酸检测均为阴性.特异度为100%。

3临床标本Uu和Up分型
68例UU阳性患者的BV标本常规分型检测Uu 阳性率为33.8%(23/68).Up阳性率57.4%(39/68), Uu+Up阳性率为5.9%(4/68),2例患者的标本(No.17和No.36)为阴性。

本方法Uu阳性率为35.3%(24/68).Up阳性率58.8%(40/68),Uu+Up 阳性率为5.9%(4/68)。

两种方法的检测一致性为97.1%(66/68)。

4
临床标本相对定量分析
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68例UU阳性患者的BV标本经Uu、Up以及内参BG标准曲线定量检测，计算标本Uu和Up相对含量，结果用四分位间距表示，即最小值、上四分位数、中位数、下四分位数和最大值。

其中Uu阳性标本的中位数为4076拷贝/10：'细胞，Up阳性标本的中位数为2092拷贝/1（T细胞（图2）。

28份Uu阳性标本检测的病原体绝对载量和相对载量见图3。

其中标本17（No.17）的Uu载量为0.9拷贝/103细胞。

标本36（No.36）的Up载量为82.1拷贝/IO'细胞。

讨论
UU是生殖道常见病原体，但在健康人群中也会携带UU,国外报道显示健康育龄妇女UU携带率在70%以上，我国健康女性UU携带率在10%〜40%et；。

UU寄居在泌尿生殖道表面，当机体免疫力降低、受到侵袭性操作或者其他病原感染侵袭时才会突破粘膜层，引起非淋菌性尿道炎，生殖道感染等疾病S随着Uu和Up的重新定义，对于UU的研究进入了更加深入和细致的阶段。

研究表明，相比于Up,女性体内乳酸杆菌减少与Uu关联更密切，超过半数的泌尿生殖道感染与Uu相关，而Up只是泌尿生殖道正常寄居菌:":。

《全国临床检验操作规程》（第3版）中也指出，UU分群是判定感染与定植的关键。

io-2I r
Uu U P
图268例UU阳性BV患者标本中Uu和Up的相对定量
Fig.2Relative quantification results of Uu and Up in68UU positive
BV patient specimens
105
104
103
102
101
10°
12345678910111213141516171819202122232425262728
A
105
104
103
102
101
10°
12345678910111213141516171819202122232425262728 101
■Uu核酸载量E3BG核酸较量
B
A上样标本核酸中Uu和EG的标准曲线定量值B计算后标本中103细胞的Uu相对定量值图328例Uu阳性患者标本荧光定量PCR核酸定量检测
A The quantitative value of Uu and BG
B The relative quantitative value of Uu of103cells
Fig.3Quantitative detection result of28Uu positive specimens
常规培养和生化技术只能检测UU,难以进行Uu 和Up种间区分；血清学技术存在交叉反应，特异性较差。

以荧光PCR为代表的核酸检测技术凭借高灵敏度和特异性逐渐成为病原检测和分型的重要方法丄本研究建立的荧光PCR方法对20株Uu 和30株Up核酸分型准确率为100%,对18种生殖道常见微生物无交叉反应，灵敏度和特异性高，检测限为10拷贝。

在临床标本分型检测中，2份UU载量低于10'1拷贝/10'细胞的标本（No.17和No.36）使用常规分型方法未能检测，而本分型方法可以检测并分型。

除分型外，UU的载量也是衡量其致病严重程度的重要指标才呵。

荧光PCR可通过建立标准曲线对血液、血清等体液量化标本中的病原体进行绝对定量检测』「汨，但生殖道标本采样量的差异导致相关病原的绝对定量意义不大。

因此本方法中引入人|3-globin 做内参基因，其一可避免采样不合格标本对检测结果的影响.提升方法的可行性；其二依据内参进行相对定量，即计算10'宿主细胞的UU量，校正标本采样差异对检测结果的影响。

图3A按照Uu从高到低的绝对定量结果对28份阳性标本排布，内参基因的含量最大
中国病原生物学杂志2020年12月第15卷第12期
Journal of Pathogen Biology Dec.2020,Vol.15,No.12・1426・
相差接近100倍，表明源自不同受检者的拭子标本采集过程中差异巨大，无法客观衡量受检者的病原携带量，必须经内参相对定量校正(图3B),其核酸载量对于受检者自身亦或不同受检者之间比较才具有意义。

本研究中，5.9%的UU阳性临床标本存在Uu和Up 混合感染，提示Uu感染的复杂性，需引起注意。

BV 患者标本的Uu和Up中位数分别为4076和2092拷贝/10'细胞，载量远高于文献报道的健康女性携带的载量「幻，侧面反映了病原体定量检测对于UU临床诊治的意义。

本研究建立的三重荧光PCR分型方法可快速完成Uu和Up分型及相对定量检测，反映宿主细胞粘附的UU量，克服采样差异对检测结果的影响，更客观反映UU载量和致病能力。

本实验检测的临床标本数量有限，方法的灵敏度、特异性以及定量精准度仍需通过加大临床样本量作进一步验证及完善。

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