基于网络药理学探讨川芎嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的保护机制

基于网络药理学探讨川芎嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的保护机制川芎嗪（tetramethylpyrazine）是从传统中草药川芎中分离得到的化合物，具有血管生成和血管保护作用以及抗炎、抗氧化等功能，临床上被长期用于治疗心脑血管疾病和炎症性疾病。

近来发现川芎嗪可以改善AP引起的胰腺和肠道损伤，通过抑制NF-κB的活化，阻断炎症因子释放和增加细胞凋亡来减轻AP的严重程度，具有治疗AP的潜能，但确切机制尚未明确。

本研究借助于网络药理学筛选出川芎嗪治疗急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis, ANP）的靶点，进行功能富集分析和通路富集分析，探讨川芎嗪治疗ANP的核心靶点及其潜在的分子机制，并进一步在ANP大鼠模型上进行初步验证，以期为川芎嗪的基础研究和临床应用提供新的思路。

材料与方法
一、川芎嗪作用靶点的获取
利用中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP），以“2,3,5,6-tetramethylpyrazine”为关键词检索川芎嗪的作用靶点，下载其mol2 格式并上传到PharmMapper网站。

靶点种类设定为Human Protein Targets Only (v2010, 2241)。

利用Uniprot数据库对获得
的靶点进行筛选，物种限定为“homosapiens”。

二、ANP相关靶点的获取
通过人类疾病信息相关数据库CTD（Comparative Toxicogenomics Database）、DisGeNET、GeneCards（The Human Gene Database)、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man），以“pancreatitis, acute necrotizing”为检索词对ANP相关基因进行检索筛查并整合，剔除重复项，获得ANP相关的候选靶点。

三、川芎嗪和ANP交集靶点蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选
将川芎嗪的作用靶点与ANP的候选靶点上传至在线韦恩图，得到川芎嗪和ANP的交集基因。

将交集基因导入STRING(Search Tool for Retrieval of Interaction Genes)数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein protein interaction networks, PPI)网络，将构建的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件，应用Network Analyzer插件进一步分析、调整后作图，并利用cytoHubba插件筛选PPI的关键靶点。

四、功能富集分析
利用R语言（4.0.3）clusterProfiler包（3.16.1）进行基因本体（gene ontology, GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes, KEGG）通路富集分析。

参数选择pvalueCutoff=0.05，pAdjustMethod=“BH”，qvalueCutoff=0.05。

GO功能富集
分析包括3个不同的水平：生物学过程，细胞组成和分子功能，根据P值从小到大选择前10位。

五、川芎嗪与ANP关键靶点分子对接
将已知的关键靶点与川芎嗪进行分子对接，得到对接亲和力，反映其稳定性。

从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank, PDB）下载核心蛋白分子结构，从TCMSP下载川芎嗪
的结构，将蛋白和川芎嗪结构导入PyMol 2.5.2和Auto Dock Tools 1.5.6软件进行分子对接及可视化处理。

六、实验动物及分组
30只250～350 g相同遗传背景的SPF级雄性SD大鼠均购自上海斯拉克公司，动物合格证号为SCXK（沪）2017 0005，按照数字表法随机分为对照组、ANP组和川芎嗪治疗
组（川芎嗪组），每组10只。

采用胰胆管逆行注射4%牛磺
胆酸钠1 ml/kg的方法建立ANP大鼠模型。

川芎嗪组在制模后5 min内经腹腔注射川芎嗪注射液10 ml/kg。

注射用盐酸川芎嗪购自平光制药股份有限公司，溶于100 ml 0.9%生理
盐水，药物浓度为0.6%。

对照组仅经尾静脉注射等容积PBS。

七、胰腺组织病理学检查及关键靶点蛋白表达检测
大鼠于制模后12 h处死，取胰腺组织，常规固定，石
蜡包埋，切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察胰腺组织
的病理学改变。

应用免疫组织化学染色检测胰腺组织表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase 3, CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1）、B细胞淋巴瘤样蛋白1（B-cell lymphoma-2-like protein 1, BCL2L1/Bcl-XL）蛋白的表达。

抗EGFR抗体（ab52894）、CASP3抗体（ab184787）、MAPK1抗体（ab109282）和BCL2L1抗体（ab32370）均购自英国ABCAM公司，二抗（PV-6001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

Image-Pro Plus 6.0图像分析系统获取染色结果的光密度值。

八、血清生物化学指标检测
大鼠处死前眼眶取血，2 000 r/min离心(离心半径9.856 cm)收集血清，－80℃保存。

采用ELISA法检测血清白介素-6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平。

IL-6、TNF-α试剂盒均购自上海江莱生物公司，按试剂盒说明书操作。

九、统计学处理
应用SPSS 26.0软件进行统计学分析。

正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD和SNK检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、川芎嗪和ANP的相关靶点
通过TCMSP、PharmMapper数据库最终得到川芎嗪的潜在靶点共142个，将靶点名称上传到Uniprot数据库，校正靶点名称并剔除重复基因，最终得到137个靶点。

从CTD、DisGeNET、GeneCards和OMIM数据库分别筛选出ANP相关基因24 575、62、1 876和150个，合计26 663个；剔除其中关联得分较小的基因，分别筛选出202、62、234和69个相关度得分较高的基因，经合并剔除重复基因后得到513个高分靶点。

二、川芎嗪和ANP交集靶点基因及PPI网络构建
将川芎嗪潜在靶点信息与ANP高分靶点信息取交集，选择同时存在于川芎嗪潜在靶点信息与ANP高分靶点信息中的靶点基因，得到川芎嗪中与ANP发病机制相关的25个作用靶点基因（图1）。

通过STRING数据库构建了川芎嗪和ANP 交集的25个作用靶点的PPI网络，发现其中5个关键靶点有相互作用，分别为白蛋白（ALB）、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1，节点度（degree)值分别为21、18、16、15、14。

三、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
对25个共同靶点基因进行GO功能分析，结果显示，生物学过程主要涉及生殖结构发育（GO：0048608）、生殖系统发育（GO：0061458）、对抗生素的反应（GO：0046677）、细胞对化学应激的反应（GO：0062197）和对活性氧的反应（GO：0000302）等；细胞组成主要为囊泡腔（GO：0031983）、膜筏（GO：0045121）、膜微区（GO：0098857）、分泌颗粒腔（GO：0034774）和细胞质囊泡腔（GO：0060205）等靶蛋白；分子功能主要包括SH2域结合（GO：0042169）、蛋白酪氨酸激酶活性（GO：0004713）、磷酸酪氨酸残基结合（GO：0001784）、蛋白酶结合（GO：0002020）和核受体活性（GO：0004879）等。

对25个共同靶点基因行KEGG通路富集分析，结果显示，与ANP的发展和治疗相关的通路主要包括Ras信号通路（hsa04014）、PI3K-Akt信号通路（hsa04151）、铂类药物耐药（hsa01524）、磷脂酶D信号通路（hsa04072）和EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药（hsa01521），以及慢性粒细胞白血病、膀胱癌和黑色素瘤等肿瘤信号通路。

四、川芎嗪与ANP关键靶点分子对接
运用AutoDockTools以半柔性对接方法将川芎嗪与上述关键靶点进行分子对接，得到川芎嗪与ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1的结合能分别为－5.06、－4.03、－3.74、－3.82、－4.33kcal/mol，平均结合能为－4.20kcal/mol。

它们之间分子对接的详细模式见图2。

五、各组大鼠胰腺组织病理学改变
对照组大鼠无腹水，胰腺形态正常，镜下见胰腺小叶结构完整。

ANP组大鼠腹腔内有大量血性腹水，胰腺、肠系膜周围可见散在的钙化斑，胰腺肿胀、周围渗出明显，并可见
出血坏死灶；镜下见胰腺腺体结构较紊乱，小叶间隙明显增大，腺泡、血管周围以及腺体间隙均可见中性粒细胞浸润。

川芎嗪组大鼠腹腔内少量腹水，胰腺轻中度肿胀伴周围少量渗出，镜下见胰腺小叶间隙略微增大，散在中性粒细胞浸润（图3）。

六、各组大鼠胰腺组织EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1蛋白表达水平
对照组胰腺组织EGFR、CASP3、MAPK1表达量分别为0.11±0.03、0.20±0.03、0.16±0.03；ANP组分别为0.31±0.04、0.43±0.05、0.33±0.08；川芎嗪组分别为0.24±0.05、0.34±0.06、0.20±0.05。

ANP组较对照组显著升高，川芎嗪组较ANP组显著降低（P值均＜0.01）；对照组、ANP组和川芎嗪组胰腺组织BCL2L1表达量分别为0.19±0.05、0.28±0.06和0.43±0.20，ANP组较对照组显著升高，川芎嗪组又较ANP组显著升高（P值均＜0.05，图4）。

七、各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平
ANP组大鼠血清IL-6和TNF-α水平均较对照组显著增高，而川芎嗪组血清IL-6和TNF-α水平均较ANP组显著降低，差异均有统计学意义（表2）。

讨论
气不通是AP的基本病机，通里攻下应贯穿治疗的始终，在疏肝解郁、清热化湿、通腑泻热、祛瘀通腑、回阳救逆的
基本治疗原则下，可采用中药口服、灌肠、外敷和针刺等内外治法相结合的多途径治疗方案。

川芎嗪是从传统中草药川芎中分离得到的化合物。

本研究共获得25个川芎嗪治疗ANP 的靶点，其中ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1为治疗的核心靶点。

一般认为配受体间相互作用的亲和力越强，所需的能量就越少，其发生作用的可能性就越大。

本研究分子对接的平均结合能为－4.20kcal/mol，表明川芎嗪与这些关键靶点蛋白均有较好的结合活性。

同时，GO功能富集分析显示，川芎嗪治疗ANP的生物学过程涉及生殖结构及系统发育、对抗生素的反应、细胞对化学应激的反应和对活性氧的反应等；KEGG通路富集分析结果表明，川芎嗪治疗ANP的主要通路富集在Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、铂类药物耐药、磷脂酶D信号通路和EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等。

MAPK1又称细胞外信号调节激酶2（extracellular signal-regulated kinase 2, ERK2），作为多种生物化学信号的整合点，参与多种细胞的增殖、分化、转录调控和发育等过程。

有研究表明，MAPK信号通路与重症急性胰腺炎的炎症反应和氧化应激损伤密切相关，通过抑制MAPK信号通路减少肠道炎症反应和菌群失调，可减轻胰腺组织损伤。

本研究结果显示，MAPK1蛋白在ANP组大鼠中高表达，与对照组比较差异有统计学意义，而川芎嗪组MAPK1表达则较ANP 组显著降低，血清IL-6和TNF-α也显著降低，说明川芎嗪
可以抑制MAPK1的表达及下游信号转导，减少IL-6、TNF-α等炎症因子的释放，从而减轻ANP后的炎症反应和氧化应激损伤。

EGFR是ErbB受体家族的成员之一，属于受体酪氨酸激酶类。

ErbB受体信号通过Akt、MAPK以及其他多种通路来调节细胞增殖、迁移、分化和凋亡。

在多种类型的恶性肿瘤中，ErbB家族成员及其部分配体通常过表达、扩增或突变，这使其成为重要的治疗靶标。

ANP小鼠存在着EGFR信号的过度激活，Fan等研究也发现EGFR可能在AP的发病机制中发挥着重要作用，可作为AP诊断和治疗的潜在生物标志物。

EGFR 配体β细胞素已被证实对AP小鼠有保护作用，雨蛙素和L-精氨酸不能诱导过表达β细胞素的转基因小鼠引发AP。

本研究发现对照组大鼠EGFR蛋白表达水平最低，ANP组表达水平最高，差异有统计学意义，经过川芎嗪干预后，EGFR表达水平则较ANP组明显降低，推测川芎嗪具有类似β细胞素的作用，能够促进胰腺β细胞新生，在胰腺再生中发挥一定的作用，对ANP具有保护性作用，可作为治疗AP的常规药物。

细胞凋亡参与AP感染性并发症的发生和进展，与ANP 多器官功能障碍有关，因而，控制细胞凋亡可能是改善ANP 临床预后的有效策略。

CASP3是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡半胱天冬酶级联反应的执行阶段起着核心作用，参与细胞凋亡、细胞坏死和炎症的信号通路。

BCL2L1/Bcl-XL则是Bcl-2家族的一种抗凋亡蛋白，是细胞凋亡的关键调节因子之一。

Loo等在研究人类多能干细胞分化为胰腺细胞的过程中观察到Bcl-XL的表达上调及caspase 3的相应下调，调节Bcl-XL的表达水平可以显著改善胰腺细胞的存活率和稳定性。

本研究发现ANP组大鼠CASP3蛋白表达水平较对照组显著升高，经川芎嗪治疗后，其表达水平则较ANP组显著降低；而BCL2L1蛋白表达水平在经过川芎嗪治疗后进一步显著升高，说明川芎嗪可以促进抗凋亡蛋白Bcl-XL表达增多，抑制caspase 3的水解，阻断酶解级联反应，进而对抗胰腺腺泡细胞凋亡，缓解胰腺炎的进展，并可能促进胰腺细胞再生。

综上所述，川芎嗪可以通过激活EGFR、MAPK1等多种信号通路，减轻ANP后的炎症反应和氧化应激损伤，增强诸如BCL2L1等抗凋亡基因的表达，阻断CASP3介导的细胞凋亡半胱天冬酶解级联反应，对牛磺胆酸钠诱导的ANP大鼠胰腺组织起保护性作用，为基础研究和临床应用提供了新的思路。