生命科学导论——细胞工程(2020年版)
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47
动物细胞的培养方式-悬浮培养
悬浮培养:是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。 主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等,或 者经过驯化的细胞。
CHO悬浮培养
48
细胞驯化
细胞驯化的实质是对细胞进行条件筛选的过程,其目的是通过改 变细胞的生长方式和生活环境以适应特定的工业化需要。
主要包括: ➢对贴壁细胞进行悬浮生长的驯化; ➢血清依赖性细胞进行无血清无蛋白培养驯化; ➢提高对NH4+等有毒代谢物的耐受,延长培养时间,提高产物浓 度
又可以共同形成生物体或组织
病毒例外
21
细胞是什么?
➢ 细胞是生命的基本结构单位,所有生物都是 由细胞组成的;
➢ 细胞是生命活动的功能单位,一切生命活动 均以细胞为基础。
➢ 细胞是生物体生长发育的基础; ➢ 细胞是遗传的基本单位,具有遗传的全能性; ➢ 没有细胞就没有完整的生命(病毒的生命活
动离不开细胞)
➢传代细胞 可在体外连续传代的细胞系,理论上具有无限传代的寿命,传代细 胞 系可以通过多种方法衍生而来。如Vero细胞、BHK21细胞、 CHO细 胞、H293细胞、杂交瘤细胞株、ST细胞、MDCK细胞等。
51
四大要素之二:细胞培养基
细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境 , 是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础 。 培养基主要包括天然培养基、合成培养基和无血 清培 养基等。
52
天然细胞培养基
天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基,直接 取 自于动物组织提取液或体液,如血清、淋巴液、胚 胎浸 出液等。 优点:营养丰富,含有细胞生长所需的各种成分 缺点:价格较贵,成分复杂,差异大、不稳定,来源也 受到限制,容易污染。 常用的有胎牛血清、小牛血清、马血清及人血清
53
合成细胞培养基
细胞 工程
50
四大要素之一:细胞株
➢原代细胞 直接来源于动物组织的细胞,动物组织经胰酶消化培养成单层细胞 (通常贴壁生长)。如地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞、 牛睾丸细胞等。有一定的传代寿命,成分复杂。
➢人二倍体细胞 采用人源细胞(通常为胚胎组织)建立的细胞株,可进行体外传代培 养,但具有一定的传代寿命,超过一定代次,细胞衰老,如2BS细胞、 KMB-17细胞、MRC-5细胞等。
1997年, “多莉”羊的
诞生标志着哺乳动物的
体细胞核克隆
日本京都大学Yamanaka研究组在一位36岁妇女的表 皮中插入一个四个与发育分化相关的基因 (Oct3/4, Sox2 , c-Myc 和 Klf4) , 成 功 得 到 了 类 胚 胎 干 细 胞
39
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
Hela细胞系
34
细胞融合
1975,Cesar Milstein与Geoger Kohler合作, 羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 融合,得到既能体外无限繁殖又能产生特异性抗 体的杂交瘤细胞。
35
胚胎工程
1978年, 英国剑桥大学 生 理 学 家 罗 伯 特 ·爱 德 华采用细胞工程技术 成功培育出世界首例 试管婴儿-路易丝-布朗。
➢合成细胞培养基的组分主要包括糖类、必需氨基酸、 维生素、无机盐类等。 ➢优点:标准化生产,成分确定,价格便宜 ➢缺点:由于天然培养基的一些营养成分不能被合成 细胞培养基完全代替,因此需在添加5%~10%的血清。 ➢动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6~7 种, 如DMEM、PRMI1640等。
54
优点:细胞贴附于其固定表面生长,比较容易更换培养液,不需要
特殊的分离细胞和培养液的设备。
缺点:该载体培养细胞放大较困难,并且不能直接监控细胞的生长
情况。
46
微载体
微载体的直径在60~250m, 由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚 合物组成,可使细胞在其表面附着生长,同时通过持续搅动使微载 体始终保持悬浮状态。 优点:比表面积大;易于检测和控制细胞的生长情况;易于培养放 大等。
生命科学导论--生物技术与生命科学
Introduction of Life Science-Biotechnology in Life Science
细胞工程
14
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
15
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
42
细胞培养基本条件
➢温度:哺乳动物细胞大部分在37oC左右 ➢气体:O2,CO2等。动物细胞通常需要供给5%CO2。 ➢光:植物细胞和少数细菌需要进行光合作用。 ➢pH:5-8 ➢渗透压:等渗 280-310 mOsm/L ➢水: 细胞水分含量60-95% ➢营养物:包括:N 源、C源,无机盐、维生素、激素。营养物和水, 称为培养液,理想的细胞培养液需要同时解决细胞培养所需要的pH、 渗透压、营养物、调节物质的全部需要。
CHO贴壁培养
CHO悬浮培养
49
细胞大规模培养技术四大要素
细胞株的选择是首要前提, 个性化细胞培养基是细胞高密度生长的营养基础, 生物反应器为细胞培养提供营养环境及功能实现的 整体控制, 根据细胞、生物反应器的特点,采用优化的个性化 细胞培养基,选用合适的细胞培养工艺是产品高产率的 关键所在。
22
细胞是生命的基本结构单位
成人约含有1014 个细胞,刚出生 的婴儿约含有 1012个细胞。人 体内有200多种 不同类型的细胞。
23
细胞是生命活动的功能单位
草履虫
草履虫应激实验 单个细胞可对外界可产生应激反应和自我调
24
节
多细胞之间的分工合作完成复杂的生命活动
25
细胞是生物体生长发育的基础
➢无菌:无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。万级净化,百级净化 ➢支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃,塑 料等作为支持物。
43
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术是细胞工程中重要的组成部分 , 是在人工条件下高密度大规模培养动、植物细胞, 用 于生产生物产品的技术。
该技术广泛应用于现代生物制药的研究和生产中 , 为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织 等产 品提供了强有力的工具。
16
细胞的基本概念
细胞是由膜包围的原生质团,通过质膜与周围 环 境进行物质和信息交流。
17
原核细胞
18
真核细胞
高尔基体
细胞核 粗面内质网 光面内质网
叶绿体 线粒体
细胞壁 细胞膜 细胞质 液泡
线粒体 中心体
高尔基体
纤毛 细胞膜 细胞质 细胞核
粗面内质网 光面内质网
植物细胞
动物细胞
19
细胞的发现
Concentration (mg/L)
4 4 4 4 4 0.4 4 7.2
200 0.1 97.67 400 6400 125
4500
15
55
Components Amino Acids Glycine L-Arginine L-Asparagine L-Aspartic acid L-Cystine 2HCl L-Glutamic Acid L-Glutamine L-Histidine L-Hydroxyproline L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine
30
细胞与组织的培养
1885年,卢克斯(Roux)发现鸡的神经元在生 理 盐水中可以存活,并使用了组织培养一词。
1907年美国胚胎学家哈里森(R. Harrison)采用 盖玻璃片悬滴培养蛙胚神经管区组织于蛙的淋巴 组 织液凝块中,存活数周,且观察到细胞生长现 象 (从细胞中长出了神经纤维细胞),开创了动物组 织培养的先河。
DMEM
Components Amino Acids Glycine L-Arginine hydrochloride L-Cystine 2HCl L-Glutamine L-Histidine hydrochloride-H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine
Robert Hooke ,1665, (英国,1635-1703) 软木薄片,蜂窝状的小格 子“细胞”(Cell)
Microscope used by Robert Hooke
20
细胞学说
➢ 所有生物都由一个或多个细胞组成 ➢ 新的细胞是已存在的细胞经过分裂分化而产
生 ➢ 每一个细胞可以是独立的生命单位,许多细胞
Concentration (mg/L)
30 84 63 584 42 105 105 146 30 66 42 95 16 104
94
Components Vitamins Choline chloride D-Calcium pantothenate Folic Acid Niacinamide Pyridoxine hydrochloride Riboflavin Thiamine hydrochloride i-Inositol Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) Magnesium Sulfate (MgSO4) Potassium Chloride (KCl) Sodium Chloride (NaCl) Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) Other Components D-Glucose (Dextrose) Phenol Red
40
细胞 工程 技术
细胞工程
大规模细胞培养 细胞融合 基因工程 干细胞工程 核移植与克隆技术 胚胎工程 组织工程
单克隆抗体 转基因生物 干细胞移植 动物克隆
试管婴儿 人工组织或器官
41 41
细胞培养
细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适 宜 温度、酸碱度和一定营养条件等),使细胞生存 、生 长、繁殖并维持主要结构和功能的一种技术。 细胞培 养也是细胞的克隆技术。
31
细胞与组织的培养
1911年卡雷尔发现鸡胚浸出液对某些细胞生长具有 很 强的促进效应,并将无菌操作引入组织培养技术 中。 并于1923年设计了卡氏动物细胞培养瓶。
D-flask
32
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912
Alexis Carrel
36
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2010
Robert G. Edwards
"for the development of in vitro fertilization".
37
细胞核移植
1958年, 英国科学 家 Grudon 将 蛙 皮 肤 细 胞核移植到去 核卵母 细胞中可发 育为新胚 胎。
眼虫的分裂
受精卵的发育分化
26
细胞是遗传的基本单位
每一个细胞都包含着全套的遗传信息,即全套的基因27
病毒的生命活动离不开细胞
HIV复制
28
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
29
细胞工程
细胞工程(Cell Engineering)是指应用现代细 胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论 与方法,按照人们的需要和设计,在细胞水平上的遗 传操作,重组细胞的结构和内含物,以改变生物的 结 构和功能,即通过组织和细胞培养、细胞融合、 核质 移植、染色体或基因移植等方法,快速繁殖和 培养出 人们所需要的新物种的生物工程技术。
"in recognition of his work on vascular suture and the transplantation of blood vessels and organs". 33
细胞系
1951年建立了第一个人体细 胞系——人体宫颈癌细胞系 Hela细胞系。至今,各国还 常用此种细胞株系进行实验 研究,如研制抗癌药物等。 现在已建了的细胞系有数万 种,大部分来源于肿瘤细胞, 极少来源正常细胞.
44
动物细胞的培养方式-贴壁培养
贴壁培养:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能 迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期。多数动 物细胞的培养都采取这种方式。
CHO贴壁培养
45
纸片载体
纸片载体是无纺聚酯纤维圆片,比表面积1200cm2/g,使用时固定
于生物反应器中,不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
动物细胞的培养方式-悬浮培养
悬浮培养:是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。 主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等,或 者经过驯化的细胞。
CHO悬浮培养
48
细胞驯化
细胞驯化的实质是对细胞进行条件筛选的过程,其目的是通过改 变细胞的生长方式和生活环境以适应特定的工业化需要。
主要包括: ➢对贴壁细胞进行悬浮生长的驯化; ➢血清依赖性细胞进行无血清无蛋白培养驯化; ➢提高对NH4+等有毒代谢物的耐受,延长培养时间,提高产物浓 度
又可以共同形成生物体或组织
病毒例外
21
细胞是什么?
➢ 细胞是生命的基本结构单位,所有生物都是 由细胞组成的;
➢ 细胞是生命活动的功能单位,一切生命活动 均以细胞为基础。
➢ 细胞是生物体生长发育的基础; ➢ 细胞是遗传的基本单位,具有遗传的全能性; ➢ 没有细胞就没有完整的生命(病毒的生命活
动离不开细胞)
➢传代细胞 可在体外连续传代的细胞系,理论上具有无限传代的寿命,传代细 胞 系可以通过多种方法衍生而来。如Vero细胞、BHK21细胞、 CHO细 胞、H293细胞、杂交瘤细胞株、ST细胞、MDCK细胞等。
51
四大要素之二:细胞培养基
细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境 , 是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础 。 培养基主要包括天然培养基、合成培养基和无血 清培 养基等。
52
天然细胞培养基
天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基,直接 取 自于动物组织提取液或体液,如血清、淋巴液、胚 胎浸 出液等。 优点:营养丰富,含有细胞生长所需的各种成分 缺点:价格较贵,成分复杂,差异大、不稳定,来源也 受到限制,容易污染。 常用的有胎牛血清、小牛血清、马血清及人血清
53
合成细胞培养基
细胞 工程
50
四大要素之一:细胞株
➢原代细胞 直接来源于动物组织的细胞,动物组织经胰酶消化培养成单层细胞 (通常贴壁生长)。如地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞、 牛睾丸细胞等。有一定的传代寿命,成分复杂。
➢人二倍体细胞 采用人源细胞(通常为胚胎组织)建立的细胞株,可进行体外传代培 养,但具有一定的传代寿命,超过一定代次,细胞衰老,如2BS细胞、 KMB-17细胞、MRC-5细胞等。
1997年, “多莉”羊的
诞生标志着哺乳动物的
体细胞核克隆
日本京都大学Yamanaka研究组在一位36岁妇女的表 皮中插入一个四个与发育分化相关的基因 (Oct3/4, Sox2 , c-Myc 和 Klf4) , 成 功 得 到 了 类 胚 胎 干 细 胞
39
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
Hela细胞系
34
细胞融合
1975,Cesar Milstein与Geoger Kohler合作, 羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 融合,得到既能体外无限繁殖又能产生特异性抗 体的杂交瘤细胞。
35
胚胎工程
1978年, 英国剑桥大学 生 理 学 家 罗 伯 特 ·爱 德 华采用细胞工程技术 成功培育出世界首例 试管婴儿-路易丝-布朗。
➢合成细胞培养基的组分主要包括糖类、必需氨基酸、 维生素、无机盐类等。 ➢优点:标准化生产,成分确定,价格便宜 ➢缺点:由于天然培养基的一些营养成分不能被合成 细胞培养基完全代替,因此需在添加5%~10%的血清。 ➢动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6~7 种, 如DMEM、PRMI1640等。
54
优点:细胞贴附于其固定表面生长,比较容易更换培养液,不需要
特殊的分离细胞和培养液的设备。
缺点:该载体培养细胞放大较困难,并且不能直接监控细胞的生长
情况。
46
微载体
微载体的直径在60~250m, 由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚 合物组成,可使细胞在其表面附着生长,同时通过持续搅动使微载 体始终保持悬浮状态。 优点:比表面积大;易于检测和控制细胞的生长情况;易于培养放 大等。
生命科学导论--生物技术与生命科学
Introduction of Life Science-Biotechnology in Life Science
细胞工程
14
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
15
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
42
细胞培养基本条件
➢温度:哺乳动物细胞大部分在37oC左右 ➢气体:O2,CO2等。动物细胞通常需要供给5%CO2。 ➢光:植物细胞和少数细菌需要进行光合作用。 ➢pH:5-8 ➢渗透压:等渗 280-310 mOsm/L ➢水: 细胞水分含量60-95% ➢营养物:包括:N 源、C源,无机盐、维生素、激素。营养物和水, 称为培养液,理想的细胞培养液需要同时解决细胞培养所需要的pH、 渗透压、营养物、调节物质的全部需要。
CHO贴壁培养
CHO悬浮培养
49
细胞大规模培养技术四大要素
细胞株的选择是首要前提, 个性化细胞培养基是细胞高密度生长的营养基础, 生物反应器为细胞培养提供营养环境及功能实现的 整体控制, 根据细胞、生物反应器的特点,采用优化的个性化 细胞培养基,选用合适的细胞培养工艺是产品高产率的 关键所在。
22
细胞是生命的基本结构单位
成人约含有1014 个细胞,刚出生 的婴儿约含有 1012个细胞。人 体内有200多种 不同类型的细胞。
23
细胞是生命活动的功能单位
草履虫
草履虫应激实验 单个细胞可对外界可产生应激反应和自我调
24
节
多细胞之间的分工合作完成复杂的生命活动
25
细胞是生物体生长发育的基础
➢无菌:无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。万级净化,百级净化 ➢支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃,塑 料等作为支持物。
43
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术是细胞工程中重要的组成部分 , 是在人工条件下高密度大规模培养动、植物细胞, 用 于生产生物产品的技术。
该技术广泛应用于现代生物制药的研究和生产中 , 为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织 等产 品提供了强有力的工具。
16
细胞的基本概念
细胞是由膜包围的原生质团,通过质膜与周围 环 境进行物质和信息交流。
17
原核细胞
18
真核细胞
高尔基体
细胞核 粗面内质网 光面内质网
叶绿体 线粒体
细胞壁 细胞膜 细胞质 液泡
线粒体 中心体
高尔基体
纤毛 细胞膜 细胞质 细胞核
粗面内质网 光面内质网
植物细胞
动物细胞
19
细胞的发现
Concentration (mg/L)
4 4 4 4 4 0.4 4 7.2
200 0.1 97.67 400 6400 125
4500
15
55
Components Amino Acids Glycine L-Arginine L-Asparagine L-Aspartic acid L-Cystine 2HCl L-Glutamic Acid L-Glutamine L-Histidine L-Hydroxyproline L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine
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细胞与组织的培养
1885年,卢克斯(Roux)发现鸡的神经元在生 理 盐水中可以存活,并使用了组织培养一词。
1907年美国胚胎学家哈里森(R. Harrison)采用 盖玻璃片悬滴培养蛙胚神经管区组织于蛙的淋巴 组 织液凝块中,存活数周,且观察到细胞生长现 象 (从细胞中长出了神经纤维细胞),开创了动物组 织培养的先河。
DMEM
Components Amino Acids Glycine L-Arginine hydrochloride L-Cystine 2HCl L-Glutamine L-Histidine hydrochloride-H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine
Robert Hooke ,1665, (英国,1635-1703) 软木薄片,蜂窝状的小格 子“细胞”(Cell)
Microscope used by Robert Hooke
20
细胞学说
➢ 所有生物都由一个或多个细胞组成 ➢ 新的细胞是已存在的细胞经过分裂分化而产
生 ➢ 每一个细胞可以是独立的生命单位,许多细胞
Concentration (mg/L)
30 84 63 584 42 105 105 146 30 66 42 95 16 104
94
Components Vitamins Choline chloride D-Calcium pantothenate Folic Acid Niacinamide Pyridoxine hydrochloride Riboflavin Thiamine hydrochloride i-Inositol Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) Magnesium Sulfate (MgSO4) Potassium Chloride (KCl) Sodium Chloride (NaCl) Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) Other Components D-Glucose (Dextrose) Phenol Red
40
细胞 工程 技术
细胞工程
大规模细胞培养 细胞融合 基因工程 干细胞工程 核移植与克隆技术 胚胎工程 组织工程
单克隆抗体 转基因生物 干细胞移植 动物克隆
试管婴儿 人工组织或器官
41 41
细胞培养
细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适 宜 温度、酸碱度和一定营养条件等),使细胞生存 、生 长、繁殖并维持主要结构和功能的一种技术。 细胞培 养也是细胞的克隆技术。
31
细胞与组织的培养
1911年卡雷尔发现鸡胚浸出液对某些细胞生长具有 很 强的促进效应,并将无菌操作引入组织培养技术 中。 并于1923年设计了卡氏动物细胞培养瓶。
D-flask
32
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912
Alexis Carrel
36
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2010
Robert G. Edwards
"for the development of in vitro fertilization".
37
细胞核移植
1958年, 英国科学 家 Grudon 将 蛙 皮 肤 细 胞核移植到去 核卵母 细胞中可发 育为新胚 胎。
眼虫的分裂
受精卵的发育分化
26
细胞是遗传的基本单位
每一个细胞都包含着全套的遗传信息,即全套的基因27
病毒的生命活动离不开细胞
HIV复制
28
细胞工程
➢ 细胞与细胞学说 ➢ 细胞工程的定义 ➢ 细胞工程研究内容 ➢ 细胞工程的应用
29
细胞工程
细胞工程(Cell Engineering)是指应用现代细 胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论 与方法,按照人们的需要和设计,在细胞水平上的遗 传操作,重组细胞的结构和内含物,以改变生物的 结 构和功能,即通过组织和细胞培养、细胞融合、 核质 移植、染色体或基因移植等方法,快速繁殖和 培养出 人们所需要的新物种的生物工程技术。
"in recognition of his work on vascular suture and the transplantation of blood vessels and organs". 33
细胞系
1951年建立了第一个人体细 胞系——人体宫颈癌细胞系 Hela细胞系。至今,各国还 常用此种细胞株系进行实验 研究,如研制抗癌药物等。 现在已建了的细胞系有数万 种,大部分来源于肿瘤细胞, 极少来源正常细胞.
44
动物细胞的培养方式-贴壁培养
贴壁培养:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能 迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期。多数动 物细胞的培养都采取这种方式。
CHO贴壁培养
45
纸片载体
纸片载体是无纺聚酯纤维圆片,比表面积1200cm2/g,使用时固定
于生物反应器中,不因为搅拌而跟随培养液一起运动。