亚健康状态人群肠道菌群结构明显失调基于某医院150例护理人员分析

肠道菌群（GM ）及其代谢产物在维持人体健康稳
态中起至关重要的作用［1,2］
，近年来，亚健康状态与肠道菌群失衡的关系越来越受到关注。

亚健康状态（SHS ）是人体处于健康和疾病之间的一种状态［3,4］，常伴有食
欲不振、腹部不适、便溏便秘等胃肠道症状［5,6］
，慢性疲劳
综合征（CFS ）为其中一种亚型［7］。

Sheedy 等［8］
基于细胞培养的技术，观察到CFS 人群肠道中的革兰氏阳性需氧菌明显占优势，尤其是肠球菌和链球菌。

Fremont 等［9］研究来自比利时和挪威的CFS 组和健康对照组肠道菌群的差异，发现CFS 组的类杆菌属（Bacteroides ）减少。

Shukla 等［10］收集了CFS 组和对照组的运动前、运动后15min 、48h 、72h 的症状报告、血液和粪便标本，发现CFS 人群主要菌群的相对丰度增加更显著，血液中细菌清除时间延长。

上述研究均提供了亚健康状态人群肠道菌群失调
Individuals with sub-health status have obviously unbalanced structure of the intestinal flora:analysis of 150nursing staff members
ZHANG Xingxing 1,2,CAI Wenwen 1,2,LIAO Shengwu 3,HE Xuanyu 1,YANG Qiuyu 4,BAI Yang 4,RUAN Weiqing 11
Huiqiao Medical Center,3Outpatient and Emergency Area,4Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2School of Nursing,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China
摘要：目的探索亚健康状态人群（SHS ）和健康人群之间肠道菌群是否存在差异。

方法于2020年11月~2021年5月选取南方医科大学南方医院工作的护理人员150例作为研究对象，其中亚健康人群75例为亚健康组（SHS 组），选择75例同期健康人群作为对照组（H 组）。

针对16S rRNA 基因的V3-V4区采用高通量测序技术，对测序结果进行多样性和物种组成差异分析。

结果α多样性分析显示，Chao1指数在SHS 组和H 组间差异无统计学意义（P =0.619），SHS 组的Shannon 指数升高且2组之间差异有统计学意义（P <0.001）；β多样性分析显示，2组间肠道菌群组成结构上差异具有统计学意义（R =0.227，P =0.001）；在门水平上2组均主要由拟杆菌门（Bacteroidota ）、厚壁菌门（Firmicutes ）、放线菌门（Actinobacteriota ）组成；在属水平均主要由普雷沃菌属（Prevotella ）、拟杆菌属（Bacteroides ）、布劳特氏菌属（Blautia ）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium ）组成；物种差异分析表明，2组在4个门3个纲3个目3个科3个属的相对丰度差异有统计学意义（P <0.05）。

结论与健康人群相比，亚健康状态人群肠道菌群结构明显失衡。

关键词：亚健康状态；肠道菌群；16S rRNA ；慢性疲劳综合征
Abstract:Objective To explore the difference in intestinal flora composition between individuals with sub-health status and healthy subjects.Methods From November,2020to May,2021,a total of 150nursing staff members in Nanfang Hospital were selected for this study,including 75participants with sub-health status (SHS group)and 75healthy participants (control group).Fecal samples were collected from all the participants for analysis of the diversity and species composition of the intestinal flora using high-throughput sequencing for V3-V4region of 16S rRNA gene.Results The results of αdiversity analysis showed no significant difference in Chao1index between the two groups (P =0.619),but the Shannon index was significantly higher in SHS group than in the control group (P <0.001).The results of βdiversity analysis showed significant differences in the community structure between the SHS group and the control group (R =0.227,P =0.001).At the phylum level,the intestinal flora in the two groups were composed mainly of Bacteroidota,Firmicutes and Actinobacteriata ,and of Prevotella ,Bacteroides ,Blautia and Faecalibacterium at the genus level.Species difference analysis identified significant differences in the relative abundance between the two groups in 4phyla,3classes,3orders,3families and 3genera (P <0.05).Conclusion Compared with healthy subjects,the individuals with sub-health status have obviously unbalanced structure of the intestinal flora.
Keywords:sub-health status;intestinal flora;16S rRNA;chronic fatigue syndrome
收稿日期：2021-09-16
基金项目：广东省科技计划项目（2019A141405048）；广州市科技计划项目（202103000037）
作者简介：张星星，在读硕士研究生，E-mail:*****************通信作者：阮伟清，副主任护师，E-mail:***************J South Med Univ,2021,41(12):1870-1876doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2021.12.17
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的证据，但由于既往研究的纳入标准、测序技术的不同，导致亚健康状态人群具体何种肠道菌群改变及变化的特点尚无定论［11,12］。

近年来，16S rRNA 测序技术的发展，弥补了传统鉴定方法无法准确鉴定细菌种属的缺点，已广泛用于肠道菌群的研究［13］，但未进一步明确何种肠道菌群失调在亚健康状态发生发展中起着重要作用。

在本研究中，我们运用16S rRNA 测序技术，比较亚健康人群和健康人群的菌群构成差异，明确其差异物种。

1资料和方法1.1临床资料
1.1.1一般资料选取2020年11月~2021年5月南方医科大学南方医院工作的护理人员150例作为研究对象，其中亚健康人群75例为亚健康组（SHS 组），男性6例，女性69例，年龄20~40岁；选择75例同期健康人群作为健康对照组（H 组），男性2例，女性73例；年龄21~40岁。

组间年龄、性别、BMI 、吸烟、饮酒差异无统计学意义（P 均>0.05），SHS 组亚健康总分明显高于H 组（P <0.05）。

由于抗生素和激素对肠道菌群影响较大［14］，要求所有志愿者在采样前2月均未接受过任何抗生素和激素治疗。

所有参与志愿者均已签署实验知情同意书。

此项研究通过医院伦理委员会批准，所有纳入的研究对象均签署知情同意书（伦理编号：NFEC-2020-278）。

1.1.2纳入标准亚健康组纳入标准：（1）年龄在20~40岁，性别不限；（2）亚健康的判定标准参照《亚健康的中
医临床研究指导原则（试行）》［3］
，满足以下条件：入组持续3个月以上反复出现的不适状态或适应能力显着减退，但能维持正常工作；无重大器官器质性疾病及精神心理疾病；尽管具有明确的非重大器官器质性疾病或精神心理疾病诊断但无需用药维持，且与目前不适状态或适应能力的减退无因果联系；（3）亚健康评定量表诊断为亚健康状态；（4）研究对象同意参加本次研究。

健康组纳入标准：（1）年龄20~40岁，性别不限；（2）无重大器官器质性疾病及精神心理疾病；（3）尽管具有明确的非重大器官器质性疾病或精神心理疾病诊断但无需用药维持；（4）亚健康评定量表诊断为健康状态；（5）研究对象同意参加本次研究。

1.1.3排除标准（1）入组前2月内曾使用抗生素、微生态制剂者；（2）过敏体质或对药物过敏者；（3）妊娠或准备妊娠、哺乳期妇女；（4）怀疑或确有酒精、药物滥用史者；（5）有消化系统疾病病史及手术史者；（6）有高血压、糖尿病、冠心病、乙肝、肺结核病史者；（7）认知功能障碍不能给予充分知情同意者。

1.2调查工具
1.2.1一般情况调查问卷调查内容包括年龄、性别、BMI 、是否吸烟、饮酒。

1.2.2亚健康评定量表［15］
该量表包括3个子量表（生理亚健康、心理亚健康和社会亚健康）、9个维度（精力、身体运动功能、社会适应、正向情绪、社会资源与社会支持、认知功能、心理症状、器官功能、身体症状）和39个条目，其中正向计分20条，反向计分19条。

采用Likert 5级评分，总分为0~100分，各维度、子量表及总量表得分越高，表示健康状况越好。

计算公式：转化分=（原始分－理论最低分）/（理论最高分－理论最低分）×100。

排除疾病人群后，当生理子量表低于阈值68，或心理子量表低于阈值67，或社会子量表低于阈值67时，被诊断为亚健康状态。

该量表Cronbach's α系数为0.917，重测信度为0.644。

1.3标本收集
本研究采取病例对照研究的方法，根据纳入、排除标准招募调查对象，首先由2名课题组成员（经过量表评定一致性培训）对调查对象进行亚健康评定量表评定，并收集调查对象的一般资料，当场回收问卷，后期由双人录入电脑中。

所有研究对象在清晨（6:00-9:00）用粪便采集管（IGE ）收集中间段没有接触空气和地面部分新鲜的粪便标本2~3g ，按操作说明混匀后在15分钟内将装有样品的采集管置于-80℃冰箱保存。

1.4DNA 提取和PCR 扩增
基因组DNA 通过E.Z.N.A.®DNA Kit （Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.）试剂盒按照说明书进行提取。

使用紫外分光光度计（ＮanoDrop 2000,Thermo Scientific)检测DNA 的浓度和纯度，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA 完整性。

使用引物515F （5'-GTGCCA GCMGCCGCGGTAA-3'）和806R6（5'-GGACTACVS GGGTATCT AAT-3'）扩增细菌16S rRNA 基因的V3-V4高可变区。

使用qiagen 公司提供的胶回收试剂盒回收产物，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。

1.5文库构建和上机测序
使用TruSeq ®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit 和Q-PCR 定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.6生物信息分析
样本委托北京诺禾致源股技术有限公司进行高通量测序，根据Barcode 序列和PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode 和引物序列后使用FLASH 软件（V1.2.7）对每个样本的reads 进行拼接，得到原始Tags 数据（Raw Tags ）。

拼接得到的Raw Tags ，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags 数据（Clean Tags ）。

参照Qiime （V1.9.1）的Tags 质量控制流程，进行如下操作：a ）Tags 截取：将Raw Tags 从连续低
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质量值（默认质量阈值为≤19）碱基数达到设定长度（默认长度值为3）的第一个低质量碱基位点截断；b ）Tags 长度过滤：Tags 经过截取后得到的Tags 数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags 长度75%的Tags 。

经过以上处理后得到的Tags 需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags 序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

通过USEARCH 软件对序列进行聚类，将序列相似度≥97%的序列归为同一OTU ，然后通过OTU 与数据库比对，对OTU 进行物种注释。

α多样性分析用Chao1指数和Shannon 指数来评估。

β多样性用基于Weighted Unifrac 距离的PCoA 分析。

基于LEfSe 方法分析，LDA 最小值设为4，进行2组之间的比较，寻找在2组之间具有显著差异的菌属。

1.7统计学方法
采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用频数和构成比描述，组间比较采用卡方检验；正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验；偏态分布的计量资料，采用中位数和四分位数M （P25，P75）描述，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。

检验水准α=0.05。

2结果
2.1亚健康组与健康组一般情况比较
2组年龄、性别、BMI 、吸烟、饮酒差异无统计学意义（P 均>0.05），SHS 组亚健康总分明显高于H 组（P <0.05）（表1）。

表1亚健康组与健康组一般情况比较
Tab.1Demographic and clinical characteristics of sub-health status group and control group BMI:Body mass index;SHMS:Sub-Health Measurement Scale;a pefers to the χ2value.
Variables
Age (year),median (IQR)Gender,n (%)Female Male
BMI (kg/m 2),Mean±SD Smoking,n (%)Yes No
Drinking,n (%)Yes No
SHMS (scores),median (IQR)
SHS （n =75)24（22，30）
69（46.0）6（4.0）20.87±2.44
4（2.7）71（47.3）
8（5.3）67（44.7)47.14（44.29，52.14）
H （n =75)25（23，30）
73（48.7）2（1.3）20.34±2.49
1（0.7）74（49.3）
10（0.7）65(43.3)55.71（52.14，67.14）
Statistics -1.716
2.114a
0.333
1.860a
0.250a
-6.368
P 0.086
0.148
0.191
0.175
0.618
<0.001
2.2亚健康组与健康组肠道菌群微生物多样性分析
2.2.1测序数据2组150个样本共获得平均每样品测得96391条tags 。

以97%的一致性将序列聚类成为OTUs （Operational Taxonomic Units ），共得到3616个OTUs 。

SHS 组独有494个OTU ，H 组独有1784个OTU ，两组共有1333个OTU （图1）。

2.2.2α多样性比较等级聚类曲线（Rank Abundance 曲线）结果表明2组肠道菌群的群落丰度较高，均匀度较好（图2）。

物种累积箱形结果显示箱形图位置趋于平缓（图3），当前样本量足够，现有的测序数据量可以反映样本中菌群的多样性信息。

本研究中菌群丰度用Chao1指数来衡量；菌群多样性用Shannon 指数来衡量，Shannon 指数越大，样品中的物种多样性越高。

结果显示，SHS 组的Chao1指数与H 组之间差异无统计学意义
（P =0.619，图4），SHS 组的Shannon 指数升高且2组之间差异有统计学意义（P <0.001，图5）。

图1SHS 组与H 组Venn 图
Fig.1Venn diagram of OTU in the two groups.
H:Healthy group;SHS:Sub-health status group.
494
1333
1784
H
SHS
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2.2.3β多样性比较主坐标分析PCoA 图显示，除个别样本存在偏差，亚健康组和健康组基本呈现在不同区域（图6）。

经过Anosim 相似性分析发现，2组间群落结构呈现显著区别（R =0.227，P =0.001）。

2.2.4肠道菌群结构分析在门水平，SHS 组中丰度最高的4个门依次为：Firmicutes （59.5%）、Bacteroidota
（31.9%）、Actinobacteriota （4.4%），变形菌门占2.5%。

而HS 组中，Bacteroidota （48.4%）、Firmicutes （41.1%）、变形菌门占5.3%、Actinobacteriota （2.5%）（图7）。

在属水平上，H 组中丰度最高的依次是：Prevotella （25.6%）、Bacteroides （19.5%）、Faecalibacterium （12.2%）、Blautia （3.3%）、Megamonas （2.1%）、Lachnospira （1.8%）、Bifidobacterium （1.8%）、Alloprevotella （1.3%）、Fusobacterium （1.3%）、Romboutsia （0.9%）。

而在SHS 组中丰度最高的依次是：Bacteroides （16.4%）、Prevotella （13.5%）、Blautia （11.8%）、Faecalibacterium （10.8%）、Bifidobacterium （3.6%）、Romboutsia （1.4%）、Lachnospira （1.3%）、Megamonas （0.6%）、Fusobacterium （0.5%）、Alloprevotella （0.3%）（图8）。

2.2.5肠道菌群差异分析在LDA 值分布柱状图中可以看出，SHS 组的优势物种为厚壁菌门，H 组的优势物种为拟杆菌门。

通过LEfSe 分析得出两组在4个门3个纲3个目3个科3个属的相对丰度差异有统计学意义
图2等级聚类曲线
Fig.2Rank abundance curves of the two groups.
0.1
0.01
0.001
1e-04
R e l a t i v e a b u n d a n c e
200
400600800
Species rank
SHS
H
图3物种累积箱型图
Fig.3Species accumulation boxplots.
3500300025002000150010005000
O b s e r v e d s p e c i e s
1143046627894113133143
Number of samples
图4Chao1指数组间差异箱形图
Fig.4Boxplot of Chao1index in the two groups.
P =0.619
C h a o 1
800
600
400
SHS
H
Group
图5Shannon 指数组间差异箱形图
Fig.5Boxplot of Shannon index in the two groups.
P <0.001
S h a n n o n
6
5
4
SHS
H
Group
图6基于Unweighted Unifrac 距离的PCoA 分析
Fig.6PCoA analysis based on Unweighted Unifrac distance.
-0.75
-0.5
-0.2500.25
0.5
PC1(44.45%)
PCoA-PC1vs PC2(P =0.001)
P C 2(10.78%)
0.20.0
-0.2SHS H
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（P <0.05，图9）。

3讨论
本研究运用16S rRNA 测序技术，对比亚健康组与健康组之间的肠道菌群，发现了亚健康组人群肠道菌群的变化特点，与健康组相比，亚健康组人群的肠道菌群组成结构和多样性上均存在显著差异。

结果显示，在α多样性分析的Shannon 指数上，SHS 组较H 组明显升高，且β多样性分析也进一步显示2组间肠道菌群组成结构上存在差异，表明亚健康人群肠道菌群多样性增加，与健康人群相比结构失衡。

本研究发现SHS 组的Shannon 指数较H 组明显升
高，这一结果与Armstrong ［16］
的研究结果相反，后者通过CFS 组和健康组的肠道菌群对比分析，发现CFS 组的物种多样性减少。

研究结果差异的原因可能为：（1）与样
本来源的人种、地域等因素造成的差异有关［17］
；（2）使用
了不同的微生物鉴定技术［18］。

在门水平，2组的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门，在属水平，2组的优势菌属均为Prevotella 、Bacteroides 。

这与人类肠道微生物群研究
的先前报告一致［19］
，人类肠道主要由厚壁菌门或拟杆菌门组成，厚壁菌门的优势属为Ruminococc 、Blautia 、Eubacterium 、Faecalibacterium ，拟杆菌门的优势属为Bacteroides 、Prevotella 。

为了进一步确定关键菌群，本研究采用LEfSe 方
图7门水平上2组的相对丰度
Fig.7Relative abundance of bacterial phyla in the two groups.
1.00.750.50.250
R e l a t i v e a b u n d a n c e
SHS
H
Sample name
Cyanobacteria
Verrucomicrobiota Desulfobacterota Euryarchaeota
unidentified_Bacteria Proteobacteria Fusobacteriota Actinobacteriota Firmicutes Bacteroidota
图8属水平上2组的相对丰度
Fig.8Relative abundance of bacterial genera in the two groups.
0.80.60.40.20
R e l a t i v e a b u n d a n c e
SHS
H
Sample name
Romboutsia Lachnospira Megamonas Blautia
Fusobacterium Bifidobacterium Faecalibacterium Alloprevotella Bacteroides Prevotella
图9LDA 分布柱状图
Fig.9Histogram of LDA score distribution.
-6.0-4.8-3.6-2.4-1.20.0 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0
LDA score (log 10)
H SHS
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法，结果发现，亚健康组的厚壁菌门、放线菌门显著高于健康组，变形菌门、拟杆菌门显著低于健康组。

这与
Giloteaux 等［20］
的部分研究结果相似。

Giloteaux 等对一人患有CFS 和另一人健康的单卵双胞胎，进行为期两天的心肺运动测试，并对运动前和运动后的粪便标本进行了16S rRNA 测序分析。

在人类肠道微生物中，厚壁菌门与拟杆菌门（F/B ）比率升高被广泛认为是肠道失调的标志，并与肥胖［21］、糖尿病［22］和心血管［23］等疾病有关。

我们在本次研究中也得到亚健康组的F/B 比率的比值高于健康组，这可能与亚健康状态的发生发展有密切联系。

本研究还发现，在属水平，亚健康组的Blautia 、Agathobacter 显著高于健康组，Prevotella 显著低于健康组，Giloteaux 等［20］也发现CFS 组的Prevotella 显著低于健康组。

Prevotella 分解蛋白质和碳水化合物，发酵膳食纤维，产生短链脂肪酸，与葡萄糖稳态和宿主代谢有关［24］，在自闭症儿童中也发现Prevotella 的减少［25］。

值得注意的是在既往研究中并未发现Blautia 的变化。

Blautia 属于毛螺菌科，可导致人体血浆IL-1β水平升高，睡眠障碍已被证明与IL-1β升高有关［26］，Smith ［27］发现Blautia 的丰度与睡眠质量呈负相关。

李媛媛等［28］也提出，Blautia 是区分慢性失眠患者与健康人的特征细菌。

睡眠障碍是亚健康状态发生发展的危险因素，也是亚健
康状态的重要表现之一［29］
，肠道菌群的改变与亚健康状
态人群的睡眠障碍及疲惫症状相关［30］
，提示我们之后的研究可以从这一方面进行深入研究。

综上所述，我们发现亚健康状态人群的肠道菌群具有整体结构失衡的特征，厚壁菌门与拟杆菌门比率升高，并明确了差异物种，亚健康人群的Blautia 、Agathobacter 显著增加，Prevotella 显著减少。

目前，亚健康状态的病因和发病机制至今尚未清楚，但菌群稳态失调可能在亚健康状态的发生发展中发挥重要的作用。

本研究通过运用高通量测序技术，将亚健康人群与健康人群进行比较研究，不仅发现二者呈现明显的不同，验证了亚健康状态影响肠道菌群多样性以及结构的组成，而且还将差异物种进一步鉴定至菌属，有望为治疗亚健康状态提供思路。

本研究的不足之处在于，仅初步分析亚健康人群肠道菌群的分布情况，随着多组学技术的发展，下一步研究将结合代谢组学、蛋白质组学等方法确定具有核心功能的亚健康人群肠道菌群种类。

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（编辑：经媛）
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