第20章 比色法和分光光度法
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
紫外可见分光光度法
有色化合物组成
Fe(CNS)52MoO(CNS)52WO(CNS)4Nb(CNS)4硅钼蓝 磷 磷钨蓝 磷钼钒杂多酸 Cu(NH3)42+ Co(NH3)62+ Ni(NH3)62+ TiO(H2O2)2+ VO(H2O2)3+ Nb2O3(SO4)2(H2O2)
颜色
红 橙 黄 黄 蓝 蓝 蓝 黄 蓝 红 紫 黄 红橙 黄
OH COOH
其结构式如下：
SO3H
可用于测定三价铁离子。
② 邻二氮菲（邻菲罗啉，1， 10—二氮菲）： 结构式为：
在PH=3～9时 与Fe2+生成红 色螯合物。用 于铁的测定。
N
N
③ 双硫腙：也叫二苯—硫腙。 结构式为：
NH S C N N NH
测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、 银、汞、镉等。
470 氧化剂存在、 碱性 570 不同酸度 490～550 (Pb520)
偶氮胂(Ⅲ) U( Ⅳ ) 、 U( Ⅵ ) 、 强酸至弱酸 665～675 (Th665) Th( Ⅳ ) 、 Zr( Ⅳ ) 、 La3+、 Ce4+、Ca2+、Pb2+等 铬天菁S Al PH5～5.8 530
5.9×104
（二）显色剂： 与待测组分生成有色化合物的 试剂叫显色剂； 分为两种 无机显色剂和有机显色剂
1．无机显色剂：
显色剂 测定元素 反应介质 /(mol/L) 鉄 0.1～0.8 HNO3
钼 钨 铌 硅 磷 钨 钒 铜 钴 镍 钛 钒 铌 1.5～2 1.5～2 3～4 0.3～0.5 0.5 4～6 1.0 浓氨水 H2SO4 H2SO4 HCl H2SO4 H2SO4 HCl HNO3
比色法和分光光度法cha
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000u m10um
波 长
100n m10n m
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm
橙 590 － 620nm
黄 570 － 590nm
绿 550 － 570nm
青 495 － 55109n0m－400nm 蓝 450 － 495nm
2. 分光光度计的基本部件
光 源
单 色 器
吸 收 池
检 测 系 统
结 果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
实例1：荧光分析法测定邻- 与间-羟基苯甲酸
➢邻- 与间-羟基苯甲酸均含有能发射荧光的苯环，但取代 基的位置不同使它们具有不同的荧光性质；
➢碱性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光的激发 下均发生荧光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有邻羟基苯甲酸发荧光；对-羟基苯甲酸在上述两种条件下均不 发生荧光，故不干扰测定。
➢对于一个可能含有邻- 、间-和对-羟基苯甲酸的样品溶液， 先在pH5.5测定邻-羟基苯甲酸含量，然后在pH12测定邻与间-羟基苯甲酸总量，计算得到间-羟基苯甲酸含量。
实例2：环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中 痕量亚硝酸盐。
比色法和分光光度法cha
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比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
2
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目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
紫外分光光度法计算
第20章 吸光光度法思 考 题1. 什么叫单色光？复色光？哪一种光适用于朗伯－比耳定律？答：仅具有单一波长的光叫单色光。
由不同波长的光所组成光称为复合光。
朗伯--比耳定律应适用于单色光。
2. 什么叫互补色？与物质的颜色有何关系？答：如果两种适当的单色光按一定的强度比例混合后形成白光，这两种光称为互补色光。
当混合光照射物质分子时，分子选择性地吸收一定波长的光，而其它波长的光则透过，物质呈现透过光的颜色，透过光与吸收光就是互补色光。
3. 何谓透光率和吸光度？ 两者有何关系？答：透光率是指透射光强和入射光强之比，用T 表示 T =tI I 吸光度是吸光物质对入射光的吸收程度，用A 表示，A εbc =，其两者的关系 lg =-A T4. 朗伯-比耳定律的物理意义是什么？ 什么叫吸收曲线？ 什么叫标准曲线？答：朗伯--比耳定律是吸光光度法定量分析的理论依据，即吸光物质溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度之间的定量关系。
数学表达式为 lg A T εbc =-=吸收曲线是描述某一吸光物质对不同波长光的吸收能力的曲线，即在不同波长处测得吸光度，波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图即可得到吸收曲线。
标准曲线是描述在一定波长下，某一吸光物质不同浓度的溶液的吸光能力的曲线，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图即可得到。
5. 何谓摩尔吸光系数？质量吸光系数？两者有何关系？答：吸光系数是吸光物质吸光能力的量度。
摩尔吸光系数是指浓度为1.0 mol·L ，液层度为1cm 时，吸光物质的溶液在某一波长下的吸光度。
用ε表示，其单位 11cm mol L --⋅⋅。
质量吸光系数是吸光物质的浓度为1g 1L -⋅时的吸光度，用a 表示。
其单位 11cm g L --⋅⋅ 两者的关系为 εM a =⨯ M 为被测物的摩尔质量。
6. 分光光度法的误差来源有哪些？答：误差来源主要有两方面，一是所用仪器提供的单色光不纯，因为单色光不纯时，朗伯—比耳定律中吸光度和浓度之间的关系偏离线性；二是吸光物质本身的化学反应，其结果同样引起朗伯—比耳定律的偏离。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
第二十章 比色法和分光光度法
3、朗伯-比尔定律
4、透光度（透射比） 5、吸光系数（吸收系数） 6、摩尔吸收系数
书P398： 例题20-1
二、吸光度的加和性 测得溶液的吸光度等于各组分的吸光度之 和。 A总 = ∑ Ai ＝κ1 b c1 + κ2 b c2 + …… κn b cn
三、朗伯-比尔定律的偏离 1、比尔定律的局限性 2、非单色入射光引起的偏离
4、颜色的产生：物质对不同波长的光具有选
择性吸收作用而产生了不同颜色。
5、光吸收曲线 6、吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
7、物质定性分析的依据：不同物质的溶液，
其最大吸收波长不同。
20.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定 1、朗伯定律 朗伯(Lambert) 1760年阐明了光的吸收程 度和吸收层厚度的关系。 A∝b 2、比尔定律 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度 和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A∝ c
一、光度分析法的特点 1、灵敏度高 2、准确度能满足微量组分测定的要求 3、操作简便快速，仪器设备简单
二、物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光称为单色光。 2、复合光：由不同波长的光组成的光称为复
合光。如可见光。 3、互补色光：两种适当颜色的单色光按一定 强度比例混合可成为一种白光，这种两种单 色光称为互补色光。
A
λ1 A
λ2
λ
λ1
λ2
λ
Aλ1= kaλ1bCa ＋kbλ1bCb Aλ2= kaλ2bCa ＋kbλ2bCb
三、光度滴定 四、酸碱解离常数的测定 五、配合物组成的测定 1、饱和法 2、连续变化法
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
分光光度法
检测器--光电管
h
(五 )
信号显示系统
作用：检测光电流强度的大小，以一定的方式显示 或记录下来。 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：记录仪，数字显示 早期的分光光度计多采用透射比T和吸光度A两种标 尺，吸光度标尺不均匀。
三、分光光度计的类型 可见分光光度计、紫外－可见分光光度计、 红外分光光度计 按结构分：单光束、双光束、双波长 单光束：参比和试液不在同一时间内测定， 由光源和检测系统不稳定而引起测量误差。
A、T、b、k的名称
A＝kbc
A 吸光度 Absorbance
光密度 Optical Density 用D或O.D表示 消光度 Extinction 用E表示 T 透射比 Transmission 透光度（率） Transmittance b 样品光程（Sample Path Length),单位为cm。 一般为 吸收池厚度。
K 吸光系数 Absorptivity
当c 的单位用g· L-1表示时，用a 表示，A＝abc 当c 的单位用mol· L-1表示时，用 表示. A＝ bc －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity 或称摩尔吸光指数 Molar Absorbancy Index
吸收系数的物理意义：不同物质具有不同的κ ，
测量条件的选择
1、测量波长的选择
2、吸光度范围的控制
3、参比溶液的选择
显色剂：无机显色剂、有机显色剂
无机显色剂与金属形成络合物稳定性差、 灵敏度和选择性都不高，应用较少。 有机显色剂与金属离子形成络合物稳定性 好、灵敏度和选择性好，应用广。
(二)显色反应条件的选择
1、显色剂的用量
2、溶液的酸度
3、时间和温度
4、有机溶剂和表面活性剂 5、共存离子的干扰及消除
分光光度法
某一波长下的吸光度。
若溶液的组成用质量浓度表示。LambertBeer 定律可表示为： A = a ·b · ：质量浓度(g ·L-1) b：为液层厚度(cm) a：质量吸光系数(L · g-1 · cm-1) a 和 的换算关系为： =aM 吸光度A与透光率T： A =－lgT = ·b ·c T = 10 - bc
CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的 黄光，透过其黄光的互补光蓝光。
又例如： KMnO4溶液，吸收了白光
中的绿光，透过的为其互补光紫色，故其 溶液呈紫色。
再例如：NaCl、KNO3溶液，对其射
入的可见光全不吸收，光全透过，因此溶 液为无色。
物质对光的吸收曲线
某一溶液对何种波长的光吸收？吸收的程度如 何？
这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度 的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的 吸收程度[吸光度， A]， 作A-λ曲线，即吸收光谱曲线。
• 图中Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ三条曲线， 代表同一被测 物质含量由低 到高的吸收曲 线。
邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光
物质的颜色：
•
•
在可见光区(400~760nm)不同波长的光具有不同的颜色。
溶液呈现一定的颜色是对光选择性吸收的结果。当一束白光 通过一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸收，另一些波长的 光则透过，溶液的颜色由透过光决定。
• 透射光与吸收光又可组成白光，这两种光称为互补色光。
溶液的颜色 ⑴溶液为什么会有颜色？ 溶液之所以呈现不同的颜色，是由于溶液中 的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。 ⑵ 吸收光与溶液颜色的关系： 当白光通过某一均匀溶液时： ①如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色； ②如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色； ③如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液 呈透过光的颜色。
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
分光光度法与比色法
2、分光光度法：也叫吸光光度法，是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的
分析方法，包括比色法、可见及紫外分光光度法及红外光谱法等。
3、比色法与分光光度法的特点
比色法和分光光度法主要应用于测定试样中微量组分的含量，它们的特点是： ①灵敏度高。常用于测定试样中1－10-3％的微量组分； ②准确度较高。比色法的相对误差为5－10％，分光光 度法为2－5％； ③应用广泛。大多无机离子和许多有机化合物都可以直 接或间接地用比色法或分光光度法进行测定； ④操作简便、快速。
三、分光光度法
与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片， 后者使用棱镜、光栅。因而分光度法比光电比色法的准确度和选择性好。 1、分光光度法的特点： (1) 用分光光度法可以得到精确细致的吸收光谱曲线。选择波长，可减小对朗伯比耳定律的偏离。分光光度计一般比较精密，分析结果的准确度高； (2) 利用吸光度的加和性可以同时测定溶液中两种或两种以上的组分；
分光光度技术 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波 长线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶 液，光虽对可见光无吸收作光光度技术吸收用，但所含物质可以吸收特定波长的 紫外线或红外线。分光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是(分光光 度法)主要是指利用物限于在可见光区，分光光度法则可以扩展 到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40－120n m，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3－5n m，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。
物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变 的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出 色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分 的含量。 光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度 作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度 或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度， 而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨 灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用 范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。
比色皿与分光光度计注意事项
玻璃比色皿和石英比色皿辨别、使用和清洗方法光度分析法是最常用的定量分析方法之一，其主要特点是：(1)应用范围广泛。
很多物质在紫外-可见光区有吸收，因此可借助于比色法进行测定。
(2)适用的浓度范围广泛，从常量分析到痕量分析(经预富集后)均可实现。
(3)灵敏度高，选择性好，精确度高，分析成本低，操作简便、快速。
因此广泛应用于地质、冶金、化工、医学、食品、制药及环境监测等行业。
在光度法中，比色皿的选择、使用和维护对分析结果有着重要的影响。
比色皿选择与鉴别比色皿的制造工艺有两种，一种是粘合剂粘合而成，另一种是高温熔融而成。
比色皿的材料通常来源于石英、熔凝硅石和光学玻璃。
玻璃比色皿对紫外线几乎全部吸收，吸光度非常大。
而石英比色皿的吸光度则小得多。
常用比色皿的形状有方形、矩形和圆筒形，容量一般为几毫升。
也有用于少量试样的微型或超微型毛细管皿。
另外还有高、低温、恒温比色皿。
比色皿有不同的光程长度，一般常用的有0．5、l、2、3、5cm ，选择哪种光程长度的比色皿，应视分析样品的吸光度而定。
当比色液的颜色较淡时，应选用光程长度较大的如2cm、3cm比色皿；当比色液的颜色较深时，应选用光程长度较小的如0.5cm 、lcm比色皿，以使所测溶液的吸光度在0.1-0.7之间。
比色皿有方向性。
有些比色皿上标有方向标记，使用时必须注意。
无方向标记的比色皿应予以校正，校正时要先确定方向并作好标记，以减少测定误差。
比色皿的校正方法是：将纯净的蒸馏水注入比色皿中，把其中吸收最小的比色皿的吸光度置为零，并以此为基准，测出其它比色皿的相对吸光度。
测定比色液时，应将其吸光度减去比色皿的吸光度。
同一组比色皿相互间的差异应小于测定误差在测定同一溶液时，吸光度差值应小于0.5％，否则应对差值进行校正。
比色皿的光程长度也需校正，校正时可将吸光度约为0.4的溶液分别注入校正皿和具有准确光程长度的标准比色皿中，测定吸光度。
以标准比色皿的吸光度为1.00，求出校正比色皿吸光度的相对值作为该比色皿的校正系数。
比色法与紫外分光光度法的异同
比色法与紫外分光光度法的异同比色法和紫外分光光度法，这俩听上去好像很复杂的科学名词，其实它们都跟“测量颜色”有关系。
嗯，简单说就是看东西的颜色，然后通过这个颜色来判断里面有什么成分。
你可能会想，这俩是不是差不多？是的，差不多，但细节上还是有点不同的，了解清楚了，能让你在实验室里也能像个小专家一样，得心应手。
比色法嘛，简单来说，就是通过溶液的颜色来判断它的浓度。
比方说，你往水里加了某种化学物质，水的颜色可能会变得更加浓烈。
你通过比较颜色的深浅，来推算浓度。
你觉得有点意思吧？其实这就像你平时看着一杯饮料的颜色，越深可能说明加糖多，越浅可能说明糖少，做化学实验也是一样。
可是，比色法有个小问题就是它受光线、溶液颜色、试剂浓度等各种因素的影响，哎，这就让它的准确性有点小小的波动。
紫外分光光度法呢，就像是比色法的“升级版”，有点像拿着超级显微镜来看问题。
它的原理是通过紫外线光源照射样品，然后测量样品吸收了多少光，最后得出结论。
简而言之，紫外线比可见光更“强”，它能穿透更多的东西。
所以，紫外分光光度法通常用来测量那些对紫外线有吸收的物质，比如药物中的有效成分，或者环境中的污染物。
这种方法不仅能量度颜色的深浅，还能更精确地定量物质的含量。
比色法和紫外分光光度法，最大的不同就体现在它们对光的“利用”上。
比色法主要依赖的是可见光，而紫外分光光度法则是通过紫外光去探测物质的特性。
就像你用手电筒和紫外线手电筒照东西，两者照出来的效果完全不一样。
比色法的测量范围一般限制在了肉眼能看到的颜色范围内，所以它适合一些比较简单的、颜色鲜明的实验；紫外分光光度法就不一样了，紫外光波长比可见光短，能“看到”更深层的东西，能测量更多“看不见”的物质。
所以，紫外分光光度法在处理一些微量物质或者需要高精度测量的场合，表现得更有“压倒性优势”。
不过，说到优缺点，它们俩也各有千秋。
比色法简单易用，设备不复杂，花费也相对便宜。
你只需要准备一个比色皿，把样品放进去，然后在一定的波长下对比颜色，就可以得出浓度。
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第20章比色法和分光光度法
【20-1】将下列百分透光度值换算为吸光度：
（1）1% （2）10% （3）50% （4）75% （5）99%
解：A＝2－lg T%
（1）A=2－lg 1 = 2.000
（2）A=2－lg 10 = 1.000
（3）A=2－lg 50 = 0.301
（4）A=2－lg 75 = 0.125
（5）A=2－lg 99 = 0.0044
【20-2】将下列吸光度值换算为百分透光度：
（1）0.01 （2）0.10 （3）0.50 （4）1.00
解：lgT%=2－A
（1）lgT1%=2－0.01 = 1.99 T1%=97.7 %
（2）lgT2%=2－0.10 = 1.90 T2%=79.4 %
（3）lgT3%=2－0.50 = 1.50 T3%=31.6 %
（4）lgT4% =2－1.00 =1.00 T4%=10.0 %
【20-3】有一有色溶液，用1.0 cm 吸收池在527 nm 处测得其透光度T = 60%，如果浓度加倍，则（1）T值为多少？
（2）A 值为多少？
（3）用5.0 cm 吸收池时，要获得T = 60%，则溶液的浓度为原来浓度的多少倍？
解：A＝－lg T =εbc －lg 0.60 = 0.222
浓度增倍时：
（1）lg T =－0.444 T= 36 %
（2）A＝－lg T = 0.444
（3）1.0cm时：c1 = 0.222 5.0cm时：c2 = 0.222
c2/c1= 1.0 /5.0 = 0.2倍
【20-4】有两种不同浓度的KMnO4溶液，当液层厚度相同时，在527nm处透光度T分别为（1）65.0%，（2）41.8%。
求它们的吸光度A各为多少？若已知溶液（1）的浓度为6.51×10-4mol·L-1，求出溶液（2）的浓度为多少？
解：（1）A＝εbc =－lgT＝－lg 0.650 = 0.187
（2）A＝－lg 0.418 = 0.379
（3）当c1= 6.51×10-4 mol • L-1时，
b = 0.187∕6.51×10-4 = 287 mol -1 • L
c 2= 0.379∕287 = 1.32×10-3 mol • L -1
【20-5】在pH=3时，于655 nm 处测得偶氮胂Ⅲ与镧的紫蓝色配合物的摩尔吸光系数为4.50×104。
如果在25mL 容量瓶中有30g La 3+，用偶氮胂Ⅲ显色，用2.0cm 吸收池在655 nm 处测量，其吸光度应为多少？ 解：A =εbc
= (4.50×104×2.0×30×10-6)∕(138.9×0.025) = 0.78
【20-6】有一含有0.088 mgFe 3+的溶液用SCN -显色后，用水稀释到50.00 mL ，以1.0 cm 的吸收池在480 nm 处测得吸光度为0.740，计算Fe(SCN)2+配合物的摩尔吸光系数。
解：ε= A ∕bc
= (0.740×55.85×50.00)∕(1.0×0.088) = 2.35 × 104 cm -1 • mol -1 • L
【20-7】当光度计的透光度测量的读数误差△T = 0.01时，测得不同浓度的某吸光溶液的吸光度为 0.010，0.100，0.200，0.434，0.800，1.20。
利用吸光度与浓度成正比以及吸光度与透光度的关系，计算由仪器读数误差引起的浓度测量的相对误差。
解：T = 10－A lg T ＝－A
0.434 c T
c T lg T
= 当 A = 0.010 时, T = 10－0.010 ，lg T ＝－0.010 , 又△T = 0.01
c
c
= 0.434 ×0.01∕10－0.010×(－0.01 0 ) =－44.4 % 同理，当A = 0.100 、0.200、0.434、0.800、1.20时，
c
=－5.46% ,－3.44 %,－2.72 % ,－3.42 % ,－5.73% c c
【20-8】设有 X 和 Y 两种组分的混合物。
X 组分在波长1λ和2λ处的摩尔吸光系数分别为1.98 × 103 cm -1 • mol -1 • L 和2.80 × 104cm -1 • mol -1 • L 。
Y 组分在波长1λ和2λ处的摩尔吸光系数分别为2.04×104 cm -1• mol -1•L 和3.13×102cm -1•mol -1•L 。
液层厚度相同，在1λ处测得总吸光度为0.301，在2λ处为0.398。
求算X 和Y 两组分的浓度是多少？
解：A 1X ＝ε1X bc X 、A 1Y ＝ε1Y bc Y
A 1总＝ A 1X + A 1Y ＝ε1X bc X +ε1Y bc (1) 同理A 2总＝ A 2X + A 2Y ＝ε2X bc X +ε2Y bc (2)
由(1) c X ＝( A 1总－ε1Y bc Y )∕ε1X b
代入(2) c Y ＝( ε1X A 2总－ε2X A 1总)∕( ε1X 2Y b －2X 1Y b ) 设 b ＝1.0 cm ，
c Y ＝( 1.98×103×0.398－2.80×104×0.301 )∕(1.98×103×3.13×102×1.0－2.80×104×2.04×104×1.0) = 1.34×10－
5 mol • L －
1
c X = ( 0.301－2.04×104×1.0×1.34×10－
5)∕(1.98×103×1.0)
= 1.40×10
－5
mol • L －
1
【20-9】某有色配合物的0.0010%水溶液在510nm 处，用2cm 吸收池测得透光度T 为0.420，已知510κ=2.5×103L·
mol -1·cm -1。
试求此有色配合物的摩尔质量。
解：A=-lgT=-lg0.42=0.376，
c=A/bε=0.376/（2.5×103×2）=7.52×10-5 mol/L
因此，1000mL 中含有色物7.52×10-5×Mg 。
已知含量为0.001%， 故1000/（7.52×10-5M ）=100/0.0010，M=131.5g/mol
【20-10】浓度为2.0×10-4mol·L -1的甲基橙，在不同pH 的缓冲溶液中，于520nm 波长处，用1cm 吸收池测得吸光度值。
计算甲基橙的p K a 值。
解：设甲基橙酸式组分和碱式组分在波长520nm 处的吸光度分别为A HL 和A L -，由已知数据
可知A HL =0.890，A L -=0.260。
所以： 311HL -41
0.890
=
4.4510L mol cm 1cm 2.010mol L
κ---=⨯⋅⋅⨯⨯⋅，
-311
-41
L 0.260= 1.3010L mol cm 2cm 10mol L
κ---=⨯⋅⋅⨯⋅ （1）用代数法求K a 。
根据HL L =
[H ]a A A A A K -
+
--计算不同pH 值时的K a 值：
pH=2.99时，K a =4.7×10-4；pH=3.41时，K a =4.5×10-4；pH=3.95时，K a =4.5×10-4。
取以上三个K a 的平均值，有K a =4.6×10-4，得到p K a =3.34。
（2）用图解法求K a ：
按已知条件A L -=0.260，A HL =0.890，计算相关数据，填入表中：
以pH 值为横坐标，L HL lg
A A
B A A
--=-为纵坐标绘图，如图所示。
直线与横坐标交点处对应的值（或与纵坐标交点处对应的值）即为p K a 。
从图中可得p K a =3.33，K a =4.7×10-4。