ConA与PHA在猪染色体制备中的比较

收稿日期:20061017基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070547;30270948)作者简介:耿克祥(1980-),男,山东单县人,吉林大学畜牧兽医学院教师,在读硕士. 通讯作者:孙金海(1959-)男,教授,博士生导师.ConA 与PH A 在猪染色体制备中的比较耿克祥1,闫守庆1,李 冰1,孙金海1,2(1 吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;2 莱阳农学院青岛校区动物科技学院,山东青岛266109) 摘要:以13/17罗伯逊易位纯合子猪[2n=36,XY 或XX,r ob (13;17)]、杂合子猪[2n=37,XY 或XX,r ob (13;17)]、正常猪为实验材料,用刀豆素A (ConA )和植物血球凝集素(P H A)两种不同的刺激源刺激外周血淋巴细胞来制备染色体,并对两种刺激源的最佳使用浓度进行了研究:ConA 的最佳浓度为:0 2mg/ml,PH A 的最佳浓度为:1mg/ml,二者同样在最佳浓度时,ConA 的制片效果显著优于PH A ,t 检验结果为:t 0 05(18)=2 101<t=2 135<t 0 01(18)=2 878.关键词:猪;罗伯逊易位;ConA ;PH A;染色体中图分类号:O 952 文献标识码:A文章编号:1673-1492(2006)06-0036-04C omparison of ConA and PHA in Preparing S ample of SwineGENG Ke -x iang 1,YAN Shou -qing 1,LI Bing 1,SU N Jin -hai1,2(1 Colleg e o f A nimal Science and Veter inary M edicine,Jilin U niversit y,Chang chun 130062,Jilin,China;2 Co llege o f Animal Science,L aiyang Ag r icultural Co llege at Q ingdao,Q ing dao 266109,Shandong ,China)Abstract:With the ho mozy gotes of 13/17Ro bertso nian translo catio n swine [2n=36,XY or XX,rob (13;17)],heterozy gotes o f 13/17Robertsonian tr anslo cation sw ine [2n =37,XY or XX,rob (13;17)]and no rmal sw ine as samples,the peripheral blood lymphocy te w as stimulated w ith ConA or PH A and the o ptimal concentration w as studied.T he results show ed that the optimal concentration o f ConA w as 0.4mg/ml or 1mg/ml fo r PH A,and the effect of ConA stim ulating w as significantly better than that of PH A (t (0.05)18=2 101<t=2 135<t (0 01)18=2 878).Key words:sw ine;Ro bertso nian translocation;ConA;PH A;chromo som e微量外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法是人类医学细胞遗传学常用的技术[1~4],在体外人工培养条件下,如在培养基中加入刺激源,则可刺激小淋巴细胞转化并进行分裂.以前人们通常使用的刺激源为植物血球凝集素(PH A ),本实验改用刀豆素A (ConA)和植物血球凝集素(PH A)两种不同的刺激源刺激外周血淋巴细胞来制备染色体,并对两种刺激源的最佳使用浓度进行了研究,为染色体的显微切割与微克隆等后续工作打下基础.1 材料与方法1 1 实验材料13/17罗伯逊易位纯合子猪,杂合子猪[5~9],正常猪,由山东六和集团种猪场提供.1 2 染色体标本的制备第22卷第6期2006年12月 (自然科学版)Jo ur nal of H ebei N orth U niv ersity (Nat ur al Science Edition)V ol 22N o 6Dec 20062006年12月 耿克祥等:ConA与PH A在猪染色体制备中的比较 第6期猪外周血淋巴细胞的培养与染色体的制备参照文献[10~12],稍加修改:本实验改用刀豆素A(Co nA)和植物血球凝集素(PH A).1 2 1 不同浓度的ConA与PH A溶液的配制表1 Co nA溶液的配制组 别浓 度Co nA灭菌生理盐水A10 18mg/ml18mg10mlA20 20mg/ml20mg10mlA30 22mg/ml22mg10ml表2 P H A溶液的配制组 别浓度P H A灭菌生理盐水B10 8mg/ml8mg10mlB21 0mg/ml10mg10mlB31 2mg/ml12mg10ml1 2 2 ConA与PH A的使用与比较 在超净台上向每个小的培养瓶里分装3m l灭菌培养基,然后向每瓶加入0 3ml ConA或PH A,为比较不同浓度的Co nA和PH A对制片效果的影响,Co nA和PH A分别设了三组不同的浓度(表1,表2).每种浓度的刺激源制备的标本片都随机选10个,在低倍镜下,每个标本片随机选10个视野,以每个标本片一个视野中平均看到的分裂相个数多少为标准,来衡量不同浓度的刺激源对制片效果的影响.2 结 果按常规方法,并作适当修改,我们获得了背景干净且分散较好的细胞中期染色体(图1,图2,图3).并得到了ConA和PH A的最佳使用浓度和t检验结果(表3,表4,表5).图1 13/17易位染色体纯合子猪细胞中期染色体标本图2 13/17易位染色体杂合子猪细胞中期染色体标本 图3 正常猪细胞中期染色体标本表3 A 组看到的分裂相数目组别ConA 浓度标本片数(个)分裂相数目(个)平均数(个)A 10 18mg/ml 105,4,4,5,6,4 74,5,4,5,5A 20 20mg/ml 104,5,5,4,5,5 45,6,5,6,6A 30 22mg/ml105,4,4,5,6,4 44,5,5,6,4表4 B 组看到的分裂相数目组别P HA 浓度标本片数(个)分裂相数目(个)平均数(个)B10 8mg/ml 104,4,3,4,5,4 24,3,4,5,4B21 0mg/ml 104,5,5,6,4,4 96,5,5,4,5B31 2mg/ml103,4,4,5,4,4 13,4,5,3,4t 检验得到如下结果:t 0 05(18)=2 101<t (A1,A2)=2 370<t 0 01(18)=2 878.A1,A2两中浓度的制片效果差异显著,A2优于A1.t 0 05(18)=2 101<t (A2,A3)=2 181<t 0 01(18)=2 878.A2,A3两中浓度的制片效果差异显著,A2优于A3.经过以上的分析得出:Co nA 的最适宜浓度为0 20m g/m l,PH A 的最适宜浓度为1 0mg/ml.表5 最佳浓度下两种刺激原看到的分裂相数目组别最佳浓度标本片数(个)分裂相数目(个)平均数(个)A 20 20mg/ml 104,5,5,4,5,5 45,6,5,6,6B21 0mg/ml104,5,5,6,4,4 96,5,5,4,5t 检验得到如下结果:t 0 05(18)=2 101<t=2 135<t 0 01(18)=2 878.A2,B2两中浓度下的ConA 与PH A 差异显著,ConA2006年12月 河北北方学院学报(自然科学版) 第6期2006年12月 耿克祥等:ConA与PH A在猪染色体制备中的比较 第6期优于PH A.3 讨 论在细胞培养过程中,ConA不但能刺激B淋巴细胞,还能刺激T淋巴细胞,故比人们常用的PH A制备的染色体标本片分裂相要多.若制得的染色体标本用于后续的染色体显微切割与微克隆研究[13~14],最好选择有丝分裂中期染色体作为染色体显微切割与分离的对象,因为有丝分裂中期染色体在形态上最易于辨别.由猪染色体核型图可见正常家猪的染色体核型为2n=38,分为4组类型,分别是:亚中部着丝粒染色体(sm)由1~5号染色体组成;亚端部着丝粒染色体(st),由6,7号染色体组成;中部着丝粒染色体(m),由8-12号和X,Y 染色体组成;近端部着丝粒染色体(t),由13-18号染色体组成.但13/17罗伯逊易位纯合子猪多了一对亚中部着丝粒染色体,少了一对近端部着丝粒染色体.虽然13/17易位染色体与1号染色体的大小、形态比较相似,但1号染色体相对长度小于13/17易位染色体,同时1号染色体的短臂明显大于13/17易位染色体的短臂.这些特征就大大减小了对易位染色体的分离难度.另外,在染色体制备过程中,由于固定液中的冰醋酸具有脱嘌呤作用而影响以后的PCR扩增,故应尽量缩短冰醋酸的接触时间.所以在固定过程中本实验采用高速短时离心.参考文献:[1] 张鸿卿,连慕兰 细胞生物学实验方法与技术[M].北京:北京师范大学出版社,1992.96-100[2] 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