当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织氧化损伤及线粒体DNA缺失的影响

当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织氧化损伤及线粒体ＤＮＡ缺失的影响李应东１　刘萍萍　周倩倩１　孙少伯１　刘　凯１　（甘肃中医学院附属医院，甘肃　兰州　７３００００） 〔摘　要〕　目的　探讨当归红芪超滤物延缓老龄大鼠脑衰老的作用及其机制。

方法　选用３月龄大鼠１２只作为青年组，选用２４月龄大鼠３６只随机分为老年组、当归红芪超滤物组、维生素Ｅ组。

给予相应处理后检测各组学习记忆功能、脑指数测定，组织形态学观察，脑组织中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力，丙二醛（ＭＤＡ）含量测定及脑组织线粒体ＤＮＡ（ｍｔ－ＤＮＡ）缺失的表达。

结果　与青年组大鼠相比：老年组大鼠学习能力下降，脑组织形态学存在差异，脑指数存在差异（P ＜０畅０５），脑组织ＳＯＤ活力明显降低，ＭＤＡ含量明显升高，脑缺失ｍｔ－ＤＮＡ／内参ｍｔ－ＤＮＡ比例明显增高（P ＜０畅０５）；与老年组相比：用药组大鼠学习能力明显增加，脑组织形态学存在差异，脑指数无明显差异，脑组织中ＳＯＤ活力显著增高，脑组织中ＭＤＡ含量显著降低，脑缺失ｍｔ－ＤＮＡ／内参ｍｔ－ＤＮＡ比例降低（P ＜０畅０５）。

与维生素Ｅ组相比，用药组大鼠学习能力、脑指数、脑组织ＳＯＤ活力、ＭＤＡ含量、脑缺失ｍｔ－ＤＮＡ／内参ｍｔ－ＤＮＡ比例均无显著差异（P ＞０畅０５）。

结论　当归红芪超滤物可能通过清除自由基，防止ｍｔ－ＤＮＡ片段丢失发挥延缓老龄大鼠脑组织衰老的作用，其功效与维生素Ｅ相当。

〔关键词〕　当归红芪超滤物；衰老；抗氧化；线粒体ＤＮＡ〔中图分类号〕　R285畅5 〔文献标识码〕　A 〔文章编号〕　1005－9202（2015）09－2347－04；doi ：10畅3969／j 畅issn 畅1005－9202畅2015畅09畅017基金项目：国家教育部“春晖计划”（Ｎｏ．Ｚ２００４－１－６２０４２）１　甘肃中医学院第一作者：李应东（１９６２－），男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事心脑血管疾病研究。

Effect of ultra －filtration extract mixture from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys on the oxidative damage of brain tissues and the expression of the mt －DNA deletion in old rats LI Ying －Dong ，LIU Ping －Ping ，ZHOU Qian －Qian ，et al 畅Affiliated Hospital of Gansu College of Traditional Chinese Medicine ，Lanzhou 730000，Gansu ，China【Abstract 】　Objective Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｕｌｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍＡｎｇｅｌｉｃａｓｉｎｅｎｓｉｓａｎｄＨｅｄｙｓａｒｉＰｏｌｙｂｏｔｒｙｓ（ＵＦＥ－ＡＨ）ｏｎｓｌｏｗｉｎｇｂｒａｉｎａｇｉｎｇｏｆｏｌｄｒａｔｓ．Methods １２ｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＷｉｓｔａｒｒａｔｓｏｆ３－ｍｏｎｔｈｓｏｌｄｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｙｏｕｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｎｄ３６ｎａｔｕｒａｌａｇｉｎｇｍａｌｅＷｉｓｔａｒｒａｔｓｏｆ２４－ｍｏｎｔｈｓｏｌｄｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅｏｌｄｃｏｎｔｒｏｌ，ＵＦＥ－ＡＨａｎｄＶｉｔａｍｉｎＥ（ＶＥ）ｇｒｏｕｐｓ．Ａｆｔｅｒａｂｏｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｂｒａｉｎｉｎｄｅｘｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｏｆＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ，ｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅ（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓａｎｄｃｏｒｔｅｘ）ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ），ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｍａｌｏｕｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ（ｍｔ－ＤＮＡ）ｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ．Results Ｔｈｅｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙａｂｉｌｉｔｙｏｆｏｌｄｒａｔｓｄｅ－ｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｙｏｕｔｈｒａｔｓ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅａｎｄｂｒａｉｎｉｎｄｅｘｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｏｌｄａｎｄｔｈｅｙｏｕｔｈ（P ＜０．０５）．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＳＯＤａｐｐａｒｅｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＭＤＡａｐｐａｒｅｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｔ－ＤＮＡｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎ－ｃｒｅａｓｅｄｉｎｏｌｄｒａｔｓ（P ＜０．０５）．ＲａｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＵＦＥ－ＡＨｈａｄｈｉｇｈｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙａｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｏｌｄｒａｔｓ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｂｒａｉｎｉｎｄｅｘ．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＳＯＤａｐｐａｒｅｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＭＤＡａｐｐａｒｅｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｔ－ＤＮＡｄｅｌｅｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｏｆｒａｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＵＦＥ－ＡＨ（P ＜０．０５）．ＲａｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＵＦＥ－ＡＨｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｉｔｈｔｈｅｒａｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＶＥｉｎａｂｏｖｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Conclusions ＴｈｅＵＦＥ－ＡＨｃｏｕｌｄｓｌｏｗｂｒａｉｎａｇ－ｉｎｇｏｆｏｌｄｒａｔｓｂｙｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇｆｒｅｅｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｓａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｆｒｏｍｍｔ－ＤＮＡｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｗｈｏｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｓｓｉｍｉｌａｒｗｉｔｈｔｈｅＶＥ．【Key words 】　ＡｐｏＣⅢ；ｍＲＮＡ；Ｂａｍａ；Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ；ＲＴ－ＰＣＲ 自由基学说是衰老的机制之一〔１〕。

衰老是过量自由基攻击生物组织细胞、核酸和蛋白质，体内的抗氧化物质，致使损伤积累战胜了机体的修复能力，改变细胞分化状态，甚至丧失，从而导致衰老〔２〕。

线粒体是细胞的能量中心，易产生氧自由基，自身又缺乏有效的清除系统，故线粒体ＤＮＡ（ｍｔ－ＤＮＡ）也是自由基损伤的重要目标〔３〕，这种损伤可使线粒体ＤＮＡ发生突变，且随增龄逐渐积累，达到一定阈值后即可导致细胞能量危机造成机体生理功能的减退引起衰老〔４〕。

线粒当归红芪超滤物合剂来自于当归，红芪按１∶５配伍所组成的补气生血之经典名方当归补血汤，目前该提取物已被证实具有良好的抗自由基〔５〕，抗氧化损伤〔６〕，促进血管新生〔７〕等功效，但在抗衰老方面尚未见相关研究，本实验以１０万分子量当归红芪超滤物作用于自然衰老雄性大鼠，通过检测学习记忆功能、脑指数，脑组织中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力，丙二醛（ＭＤＡ）含量及脑组织ｍｔ－ＤＮＡ，以期探讨其延缓脑衰老的作用及机制。

1　材料与方法1畅1　实验动物　选用ＳＰＦ级雄性３、２４月龄的Ｗｉｓｔａｒ大鼠，实验动物购自甘肃中医学院医学实验中心，ＳＰＦ级动物合格证号：ＳＣＸＫ（甘）２０１１－０００１。

1畅2　药品及试剂　维生素Ｅ胶丸（青岛双鲸药业）；当归红芪超滤物（甘肃中西医结合研究所和甘肃省膜科院联合提供）；ＳＯＤ试剂盒、ＭＤＡ试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（均购自南京建成生物研究所）；ＧｏＴａｑＧｒｅｅｎｍａｓｔｅｒｍｉｘ（美国Ｓｉｇｍａ公司）；ｍｔ－ＤＮＡ引物（南京金斯瑞生物科技有限公司）；柱式动・７４３２・李应东等　当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织氧化损伤及线粒体ＤＮＡ缺失的影响　第９期物线粒体ＤＮＡ提取试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司）。

1畅3　仪器　ＢＰ２１１Ｄ型电子天平（瑞士Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；ＵＶ－２４０１ＰＣ型紫外可见分光光度仪（日本岛津）；台式低温高速离心机（ＰＬＣＯ型，德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）；ＭＤＦ－３８２型低温冰箱（日本三洋公司）；美国亚培全自动酶标分析仪；ＰＣＲ扩增仪（ＰＥ２４００型，美国ＰＥ公司）；Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验系统和ＢＩ２０００图像分析系统（成都泰盟公司）。

1畅4　动物分组与给药　分组：选用ＳＰＦ级雄性，３月龄的青年Ｗｉｓｔａｒ大鼠１２只，体重（１６０畅８±９畅３）ｇ，作为青年组（Ａ组）；ＳＰＦ级雄性，２４月龄的老龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠３６只，体重（４６１畅６±３６畅８）ｇ，随机分为老年组、当归红芪超滤物组、维生素Ｅ组，每组１２只，给药：各组大鼠在相同条件下适应性喂养７ｄ后，开始进行实验。

当归红芪超滤物组给予１０万分子量的当归红芪超滤物，每次１９畅４２８ｇ生药・ｋｇ－１・ｄ－１（每克生药可提取１０万分子量当归红芪超滤物０畅１１１ｇ），维生素Ｅ组给予维生素Ｅ，每次５４ｍｇ・ｋｇ－１・ｄ－１，青年组和老年组均给予同体积生理盐水７ｍｌ・ｋｇ－１・ｄ－１，每天灌胃１次，连续７０ｄ。

1畅5　大鼠学习记忆功能检测（水迷宫实验）　７０ｄ以后开始行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验，该实验分为定向航行实验和空间探索实验。

先对大鼠进行３ｄ训练，第４天开始定向航行试验，记录第４、５天大鼠的逃避潜伏期，并取其平均值作为大鼠学习能力的检测指标。

第６天行空间探索实验，记录大鼠穿越平台次数来作为判断大鼠记忆能力的指标。

1畅6　脑指数测定　水迷宫测试结束，大鼠禁食１２ｈ，测量记录大鼠体重（ｇ）；注射水合氯醛麻醉固定，冰上快速取脑，盐水冲净并滤干，称取脑组织重量（ｇ）；脑指数＝脑重量／动物重量。

1畅7　光学显微镜下组织形态学观察　称重完毕分离大鼠左侧颞叶大脑皮质和左侧海马，福尔马林溶液固定，不同浓度乙醇逐级脱水，二甲苯溶液，石蜡中浸泡后包埋，切片，然后脱蜡，染色、脱水、透明、封固、晾干，光学显微镜下观察组织形态。

以上操作由甘肃中医学院病理教研室协助完成。

1畅8　生化法测定脑组织ＳＯＤ活力、ＭＤＡ含量　剩余脑组织称重，用４℃生理盐水制备成１％，１０％的组织匀浆，３０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，取上清液行ＳＯＤ活力、ＭＤＡ含量检测。