共聚焦激光扫描荧光显微镜-基本原理、应用及样本制备原则_图文.
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
共聚焦激光扫描PPT课件
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共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
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Wide-field microscopy
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Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
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基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
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Confocal microscopy
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Confocal Principle
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦[知识研究]
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业界荟萃
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荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
2 在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平
面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小
孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由
于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上
的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不在
探测针孔处成像，即共聚焦。 以激光作光源并对样品进行扫
描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
业界荟萃
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只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
业界荟萃
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弧灯 膜
目镜
业界荟萃
孔
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02 应用
业界荟萃
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业界荟萃
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Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
业界荟萃
Pyr
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黑麦草
业界荟萃
洋葱
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北京化工 大学
业界荟萃
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业界荟萃
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激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
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02 应用
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荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
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目录
01 原理 02 应用
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01 原理
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荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理
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• 利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探 测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔 与探测针孔对被照射点或被探测点来说是 共轭的，因此被探测点即共焦点。
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• 1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）
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假设是场照明（非共聚焦），会导致： 一.发生衍射，使像模糊； 二.散射光干扰（即除了成像点外，其余 点处有散射光进入探测针孔）；
• （二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及 检测器)
• （三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布， 调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范 围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信 号。
• （四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优 化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品 荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号 的分解及合成图像，对其进行定量测定。
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• 一. X—Y轴扫描 • 二. Z轴扫描
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• （1）单光束扫描模式
• 其中最常见的扫描安排结合了两个独立的 扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直 轴的反射镜即在试样上产生X—Y平面的扫 描。但中间需要增加高级别的像差校正光 学系统，导致发光效率降低。
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• （1）单光束扫描模式
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• （2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描）
• 多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描 配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档
思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分 离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名 为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、 伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对 物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内 有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)
共聚焦激光扫描荧光显微镜
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共
振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。
应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合
与分离பைடு நூலகம் 大分子构象的改变
Fluorescence Intensity
4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监 测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成
Ligand
Cy5 Cy3
Time
3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理激光扫描共聚焦荧光显微镜原理一、概述激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）是一种高分辨率、高灵敏度的生物成像技术，它通过激光和荧光探针相互作用，实现对生物样品的高清晰成像。
本文将详细介绍LSCM的原理。
二、激发荧光信号的原理LSCM是基于荧光成像技术的，因此了解荧光信号的产生机制非常重要。
在LSCM中，通常使用的探针为有机染料或蛋白质标记物。
这些探针受到激发波长（通常为紫外线或蓝色激光）后会被“激发”到一个高能态，并在短时间内返回基态时释放出能量，即产生荧光信号。
三、扫描共聚焦显微镜系统结构1. 激光器：LSCM中通常使用的激光器为氩离子激光器和氦氖激光器。
它们可以提供不同波长的激发波长，以满足不同探针的需求。
2. 光学系统：光学系统包括激光束聚焦、激光扫描和探测系统。
其中，激光束聚焦是将激光束聚焦到样品上的过程，通常使用的是物镜；激光扫描是将激光束在样品表面移动的过程，通常使用的是振镜；探测系统用于收集荧光信号，并将其转化为数字信号。
3. 样品台和样品固定装置：样品台用于放置样品，通常可以进行XYZ三向移动。
样品固定装置可以确保样品不会在成像过程中移动或震动。
4. 计算机：计算机用于控制整个系统，并处理、分析和显示成像数据。
四、扫描共聚焦显微镜成像原理1. 感应体积：感应体积是指在LSCM中能够产生荧光信号的三维区域。
它由两个因素决定：一个是物镜的数值孔径（NA），另一个是激发波长。
感应体积越小，则分辨率越高。
2. 扫描方式：LSCM采用的是点扫描或线扫描方式。
点扫描方式是将激光束聚焦到样品上的一个点，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕；线扫描方式是将激光束聚焦成一条线，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕。
3. 探测方式：LSCM采用的是共聚焦探测方式。
共聚焦探测可以减少背景信号和散射信号的干扰，提高成像信噪比。
五、LSCM应用LSCM广泛应用于生物学研究中，如细胞生物学、神经科学、分子生物学等领域。
共聚焦激光扫描荧光显微镜
激发波长
464nm 507nm 507nm 420/480nm 494nm
发射波长
526nm 530nm 535nm 637nm 520nm
Kd 390nM 190nM 550nM 140nM 20,000nM
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描
激发光(EXCITATION)：
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
武汉大学医学院结构生物学研究中心
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
宋健
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
供体荧光素 (Cy2)
共聚焦激光扫描显微镜
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
光电倍增管
检测 针孔 共聚焦装置
光源 针孔
X/Y扫描 扫描 装置
荧光显微镜 步进聚焦电机
物镜
Bio-Rad LaserSharp
系统操作， 系统操作，图像处理 3-D重建 重建
光电倍增管
共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
检测系统
LSCM为多通道荧光采集系统， LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少 为多通道荧光采集系统 有三个荧光通道和一个透射光通道， 有三个荧光通道和一个透射光通道，可对物体 进行多谱线激光激发. 进行多谱线激光激发. 样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光 电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以 电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器， PMT 12 转换器 做光子计数。 做光子计数。 每个PMT前设置单独的针孔，由计算机软件 每个PMT前设置单独的针孔， PMT前设置单独的针孔 调节针孔大小， 调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色 片组，满足不同测量的需要。 片组，满足不同测量的需要。
488nm 520nm
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。 BP450带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 短通滤色镜组合（ KP）： ）：LP450 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微分离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……Conventional fluorescence microscope Confocal microscope历史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987Zeiss 、Leica 、Meridian 、OlympusZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.D. Phase-contrast or adifferential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.常用荧光探针Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理介绍激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LS-CFM）是一种先进的显微镜技术，用于获取高分辨率的细胞和组织图像。
它基于激光光源和共聚焦原理，通过激发标记的荧光物质来提高显微镜的分辨率和对比度。
本文将详细介绍LS-CFM的原理和应用。
激光扫描共聚焦显微镜的工作原理激光光源LS-CFM使用激光光源作为激发荧光物质的光源。
激光光源具有高强度、单色性和方向性，可以提高显微镜的灵敏度和分辨率。
扫描系统LS-CFM的扫描系统包括镜片、扫描镜和探测器。
激光光束经过镜片聚焦到样本上，扫描镜通过改变反射角度来扫描样本表面，探测器记录荧光信号。
共聚焦原理共聚焦原理是LS-CFM的核心原理，它通过控制扫描镜的运动和探测器的观察位置，只获取样本特定平面（焦平面）的荧光信号。
由于样品处于共焦面上时探测荧光的最大值，可以得到高分辨率图像。
荧光物质激发和发射过程在LS-CFM中，荧光物质被激光光源激发后会发射荧光。
荧光物质的发射波长通常比激发波长长。
激发光和发射光通过不同的光路，以避免激发光干扰荧光信号。
LS-CFM的优势1.高分辨率：共聚焦原理使LS-CFM能够获取超过传统荧光显微镜的分辨率，可以观察更细微的结构和细胞器。
2.高对比度：由于共焦面上只有样品发出的荧光被探测到，背景信号减少，对比度更高。
3.深度扫描能力：LS-CFM具有深度扫描能力，可以获取样本的三维图像。
这对于观察细胞内部结构和复杂的生物组织是非常重要的。
4.实时观察：LS-CFM可以实时地观察样本，能够捕捉到细胞和组织的动态变化。
5.多光标标记：通过使用不同的荧光标记剂，LS-CFM可以同时观察多个分子或细胞器的位置和相互作用。
LS-CFM的应用生物医学研究LS-CFM在生物医学研究中扮演着重要的角色。
它可以用于观测细胞分裂、细胞迁移、细胞凋亡以及细胞器的分布和运动。